海馬認知障礙對血脂水平的影響及其與肝臟HMG-CR表達的關系

韋日明　李統四郭亞芬杜　森　夏春波　(桂林醫學院，廣西　桂林　54004)

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海馬認知障礙對血脂水平的影響及其與肝臟HMG-CR表達的關系

韋日明李統四1郭亞芬2杜森夏春波(桂林醫學院，廣西桂林541004)

〔摘要〕目的探討海馬認知障礙對血脂水平的影響及其與肝臟3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG-CR)表達的關系。方法采用Aβ1～42大鼠海馬內注射構建認知障礙模型，全自動生化分析儀檢測血脂水平，半定量反轉錄-聚合酶鏈反應法(RT-PCR)檢測肝臟HMG-CR mRNA的表達，蛋白印跡法檢測肝臟HMG-CR的表達。結果①實驗組大鼠甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)分別為(2. 30± 0. 08)mmol/L、(4. 60±0. 10)mmol/L、(2. 41±0. 06)mmol/L，與假手術組和對照組相比均顯著升高(P＜0. 05)。②實驗組大鼠肝臟HMG-CR mRNA表達水平為0. 49±0. 03，明顯高于假手術組和對照組(P＜0. 05)。③實驗組大鼠肝臟HMG-CR表達水平為0. 50±0. 02，顯著高于假手術組與對照組(P＜0. 05)。結論海馬認知障礙可引起大鼠血脂水平升高，其機制可能與認知障礙大鼠肝臟HMG-CR表達水平升高有關。

〔關鍵詞〕認知功能障礙;脂代謝; 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶

1岑溪市中醫醫院2廣西大學

第一作者:韋日明(1978-)，男，講師，廣西大學在讀碩士，主要從事分子生物學的基礎應用和疾病動物模型的研究。

大腦海馬與認知功能的關系一直是研究熱點〔1〕，但對內臟活動的影響知之甚少。臨床上，老年癡呆患者常常伴有代謝水平異常，高達81%的散發性老年癡呆患者有不同程度的代謝異常〔2〕。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG-CR)是脂代謝的關鍵酶，為深入揭示認知功能障礙對血脂代謝的影響及其發生機制，本研究通過制備認知障礙模型，分析血脂水平變化與肝臟HMG-CR表達水平的關系。

1　材料與方法

1. 1實驗材料與試劑30只健康SD大鼠(雌雄不分，200～250 g)，由桂林醫學院實驗動物中心提供，合格證號: SCXK桂2007-000。β淀粉樣蛋白(Aβ1～42)購自美國Sigma公司，總RNA提取試劑盒以及逆轉錄試劑盒均為TaKaRa公司產品，HMG-CR、β-actin引物序列由invitrogen公司設計并合成，HMGCR上游引物: 5＇-CCTTCTACCTCAGCAAGCCT-3＇，下游引物: 5＇-GATGCTCAAGCTGCCTTC T-3＇，產物為243 bp;β-actin上游引物: 5＇-GAGGGAAATCGTGCGTGAC-3＇，下游引物: 5＇-CTGGAAGGTGGACAGTGAG-3＇，產物為445 bp。HMG-CRpAb、β-actinpAb 為Bioworld Technology公司產品，辣根酶標記山羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1. 2大鼠認知障礙模型制備及實驗分組30只健康SD大鼠隨機分成三組，每組10只。將大鼠腹腔麻醉(10%水合氯醛，3 ml/kg)，頭部備皮，參照《大鼠腦立體定位圖譜》將大鼠固定于腦立體定位儀上，沿其頭頂切開長約1 cm的縱形切口，分離骨膜，牙科鉆在右側海馬上方(前囟后3. 8 mm，右旁開2. 2 mm)打孔。實驗組:微量注射器進針2. 9 mm海馬內注射Aβ1～4215 μg;假手術組:注射等體積磷酸鹽緩沖液(PBS);對照組:不作任何處理。Morris水迷宮實驗檢測大鼠認知功能，以大鼠逃避潛伏期、在原平臺象限時間百分比、跨越平臺次數三項指標中的任意兩項與對照組差異有統計學意義評定為認知功能障礙。

1. 3大鼠血脂水平的檢測大鼠飼養45 d后，腹腔麻醉，胸部備皮，1 ml注射器心臟取血約0. 8～1 ml，分離血漿，全自動生化分析儀檢測甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平。

1. 4大鼠肝臟組織樣本采集大鼠腹腔麻醉，腹部備皮，打開腹腔并剪取部分肝臟組織，快速放入液氮中，12 h后將大鼠肝臟組織從液氮中轉移至－80℃冰箱備用。

1. 5 RT-PCR法測定肝臟HMG-CR mRNA的表達水平在液氮中充分研磨肝臟組織，利用TaKaRa總RNA提取試劑盒提取樣本總RNA，紫外分光光度計檢測總RNA的純度和濃度，TaKaRa逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄為穩定的cDNA，運用HMG-CR引物和β-actin引物進行PCR擴增，反應條件:預變性94℃2 min，變性94℃30 s、退火63℃30 s、延伸72℃30 s共32個循環，終延伸72℃2 min。1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，全自動數碼凝膠成像分析系統拍照，并分析。

1. 6 Western印跡法測定肝臟HMG-CR的表達水平在液氮中充分研磨肝臟組織至粉末狀，加入蛋白組織細胞裂解液(RIPA)中15 min，離心并取上清，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒檢測組織蛋白質濃度，制備上樣蛋白樣本，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，蛋白質轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂牛奶封閉，孵育HMG-CR(β-actin)一抗，Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜，孵育二抗，TBST洗膜，PVDF膜發光，測定蛋白條帶灰度值，并分析。

1. 7統計學分析應用SPSS17. 0軟件行單因素方差分析。

2　結果

2. 1各組大鼠血脂水平比較大鼠飼養45 d后，表現為體型偏瘦、行動遲鈍、毛發淡黃且粗糙:實驗組大鼠TG、TC、LDL-C均明顯高于假手術組和對照組(P＜0. 05)，HDL-C水平無統計學差異(P＞0. 05)。見表1。

2. 2各組大鼠肝臟HMG-CR mRNA的表達情況實驗組大鼠肝臟HMG-CR mRNA表達水平為0. 49±0. 03，明顯高于假手術組與對照組(分別為0. 24±0. 02和0. 22±0. 01)(P＜0. 05)，假手術組與對照組相比無明顯變化(P＞0. 05)。見圖1。

2. 3各組大鼠肝臟HMG-CR的表達情況實驗組大鼠肝臟HMG-CR的表達水平為0. 50±0. 02，明顯高于假手術組(0. 28±0. 02)與對照組(0. 27±0. 03)(P＜0. 05)，假手術組與對照組相比差異無統計學意義(P＞0. 05)。見圖2。

表1　各組大鼠血脂水平(x ±s，mmol/L，n=10)

圖1　肝臟HMG-CR mRNA的表達

圖2　肝臟HMG－CR的表達

3　討論

老年癡呆也稱作阿爾茲海默病(AD)，其主要特征為記憶缺失、認知損害和人格改變，并逐漸進展為嚴重認知障礙。AD與脂代謝關系密切，有研究表明〔3〕，AD患者體內HDL與TC水平呈動態表達。黃德弘等〔4〕對51例AD、43例血管性癡呆(VD)以及30例正常人血脂檢測發現，與正常組相比，AD與VD患者血清TC、LDL-C、TG水平顯著升高。也有學者發現，AD患者與正常人相比，TC、LDL、TG水平明顯升高〔5〕。另有報道〔6〕，認知障礙大鼠海馬神經元凋亡增加，且TC、TG、LDL水平顯著升高，推測AD大鼠導致脂代謝異常與海馬神經元凋亡增加有關。本實驗也提示大鼠認知功能障礙可能會引起血脂水平升高。

HMG-CR是脂質代謝的關鍵酶〔7〕，蛋白激酶可以催化HMG-CR發生磷酸化從而失去活性。胰高血糖素通過影響蛋白激酶的活性，促使HMG-CR磷酸化，降低膽固醇的合成，而胰島素則可以通過增加HMG-CR的去磷酸化，提高HMG-CR水平及活性，促進膽固醇的合成。本實驗推測認知障礙大鼠血脂水平升高可能與肝臟HMG-CR表達升高有關，但認知障礙大鼠肝臟HMG-CR表達升高的機制尚不清楚。

海馬在大腦邊緣系統中占有重要的地位，海馬神經元凋亡可以促進認知功能障礙的發生發展。海馬神經元與周圍神經核團廣泛聯系，如下丘腦室旁核(PVN)、前腦終紋床核(BNST)、杏仁核等。下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸(HPA軸)是中樞神經系統參與內臟調節主要通路，HPA軸的激活點位于PVN。研究表明〔8〕，海馬可以通過HPA軸參與機體的調節。此外，Guan等〔9〕通過運用顯微注射器海馬內注射胃動素研究發現，海馬可以影響胃腸蠕動，并且海馬CA3區的神經元對胃擴張敏感，而膈下迷走神經切斷幾乎可以完全阻斷海馬對胃腸動力的影響，提示海馬與迷走-迷走神經反射通路之間具有功能性的相互作用。另有研究表明〔10〕，海馬可以通過自主神經參與機體的代謝調節。

綜上，海馬可能會通過多種神經傳導通路參與機體代謝調節，推測在本實驗中肝臟HMG-CR表達水平升高可能與認知障礙大鼠海馬神經元受損有關。

4參考文獻

1 Hu R，Huang D，Tong J，et al．Aspartic acid in the hippocampus: a biomarker for postoperative cognitive dysfunction〔J〕．Neural Regener Res，2014; 9(2): 143-52.

2 Biessels GJ，Staekenborg S，Brunner E，et al．Risk of dementia in diabetes mellitus: a systematic review〔J〕．Lancet Neurol，2006; 5(1): 64-74.

3王林輝，田茗源，余剛，等.慢性腦血流灌注不足對老齡大鼠海馬組織CA1區ABCA1的表達及脂代謝的影響〔J〕．中國生物制品學雜志，2012; 25(6): 693-6.

4黃德弘，劉孟淵.阿爾茨海默病和血管性癡呆患者血脂、血糖及尿酸水平的變化〔J〕．廣東醫學，2013; 34(4): 587-9.

5李欽云，陳崢，張守字，等. 126例阿爾茨海默病患者血脂代謝和胰島素抵抗的研究〔J〕．中華全科醫學，2015; 13(1): 15-7.

6杜森，夏春波，葉琳，等.大鼠海馬認知障礙對糖脂代謝的影響及其與海馬神經元凋亡的關系〔J〕．中國老年學雜志，2015; 35(4): 1000-1.

7 Lin P，He YR，Lu JM，et al．In vivo lipid regulation mechanism of polygoni multiflori radix in high-fat diet fed rats〔J〕．Evid Based Complement Alternat Med，2014; 2014: 642058.

8 Paul S，Jeon WK，Bizon JL，et al．Interaction of basal forebrain cholinergic neurons with the glucocorticoid system in stress regulation and cognitive impairment〔J〕．Front Aging Neurosci，2015; 7: 43.

9 Guan Y，Tang M，Jiang Z，et al．Excitatory effects of motilin in the hippocampus on gastric motility in rats〔J〕．Brain Res，2003; 984(2): 33-41.

10 Mozaffarian F，Jogataii MT，Alizadeh A，et al．Post pubertal behavioral changes in rats with neonatal lesions of the ventral hippocampus〔J〕．Saudi Med J，2011; 32(2): 192-4.

〔2015-02-11修回〕

(編輯袁左鳴)

The effects of cognitive impairment in hippocampus on lipid levels and its relations with the expression of HMG-CR in liver

WEI Ri-Ming，LI Tong-Si，GUO Ya-Fen，et al．
Guilin Medical University，Guilin 541004，Guangxi，China

【Abstract】Objective To investigate the effects of cognitive impairment in hippocampus on lipid levels and its relations with the expression of HMG-CR in liver．Methods The Aβ1～42was injected into the hippocampus of rats to build cognitive impairment model，automatic biochemical analyzer were used to detect lipid levels，the expression of HMG-CRmRNA in liver was detected by RT-PCR，the expression of HMG-CR in liver was detected by Western blot．Results①In experimental group，the levels of total triglyceride(TG)，total cholesterol(TC)，low-density lipoprotein(LDL)were significantly higher than those of sham and control groups(P＜0．05)．②The expression of HMG-CR mRNA in liver of experimental group was significantly increased comparing with that of control and sham groups(P＜0．05)．③The expression of HMG-CR in liver of experimental group was significantly increased comparing with that of control and sham groups(P＜0．05)．Conclusions

Cognitive impairment in hippocampus could cause lipid levels elevating，which might be related to the increasing of the expression of HMGCR in liver．

【Key words】Cognitive impairment; Lipid metabolism; HMG-CR

通訊作者:夏春波(1977-)，男，碩士生導師，副教授，主要從事認知障礙與代謝疾病的研究。

基金項目:國家自然科學基金資助項目(No．81260137)

〔文章編號〕1005-9202(2015)20-5683-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 002

〔文獻標識碼〕A

〔中圖分類號〕R338. 2+6