JAK2-STAT3信號通路在大鼠腦出血模型中的作用

王緒常　張振興宋曉峰　李樹玲　周青青　(遼寧醫學院，遼寧　錦州　200)

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JAK2-STAT3信號通路在大鼠腦出血模型中的作用

王緒常張振興1宋曉峰李樹玲周青青(遼寧醫學院，遼寧錦州121001)

〔摘要〕目的探討大鼠腦出血后JAK2-STAT3信號通路的作用機制及與腦水腫的關系。方法健康雄性SD大鼠108只，經尾動脈取血緩慢注射到尾狀核區制作大鼠腦出血模型。根據出血時間不同，采用隨機數字表法將其分為3 h、9 h、1 d、3 d、5 d和7 d 6組，每個組又分為3個亞組:模型組、假手術組和AG490組。采用免疫組織化學和Western印跡檢測JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3的表達，并測定腦組織含水量。結果與假手術組和AG490組相比，模型組中p-JAK2和p-STAT3大量表達，并于24 h時達到高峰;與模型組相比，AG490組大鼠腦組織含水量在各時間點均較低。結論腦出血后能夠激活JAK2-STAT3信號通路，并導致腦組織水腫。

〔關鍵詞〕JAK2; STAT3;腦出血

1遼寧醫學院附屬第一醫院

第一作者:王緒常(1988-)，男，在讀碩士，主要從事腦血管疾病的基礎和臨床研究。

JAK2-STAT3信號通路是近年新發現的一條細胞內信號轉導途徑，與抑制炎性反應、腫瘤、神經病理性疼痛、神經退行性變及腦缺血等中樞神經系統疾病的病理生理過程密切相關〔1～5〕。但該系統在腦出血中表達變化尚未明確。本實驗通過制作腦出血模型初步了解JAK2/STAT3信號通路的動態變化，探討其作用機制。

1　材料與方法

1. 1材料JAK2抗體，p-JAK2抗體，STAT3抗體，p-STAT3抗體，二抗(Santa Cruz公司); DW-2000立體定向儀(成都泰盟科技有限公司);微量進樣器(上海高鴿工貿有限公司);鉆孔機(鄭州市一美牙科工業有限公司);電子天平(Denver Instrument Company A-200型，DS美國);切片機;電泳系統(北京六一公司);手術器械包;消毒液?等。

1. 2方法

1. 2. 1實驗動物與分組健康雄性SD大鼠108只，體質量250～300 g，許可證號: SCXK(遼)2010-0001，由遼寧長生生物技術有限公司提供。室溫25℃左右，正常飼料喂養，自由攝水和食物，每日更換墊料。根據出血時間的不同，按照隨機數字表法分為6組(n=18): 3、9 h、1、3、5、7 d組。每組中又按照隨機數字表法隨機分為3個亞組:①模型組(M組);②假手術組(S 組);③AG490組(AG組)，每組6只。每組中3只用來做免疫組化檢測，3只用來做蛋白印跡檢測。M組:刺破尾動脈取得動脈血，緩慢注射到尾狀核區制作出腦出血模型。S組:除了腦內不注入動脈血液外，其他操作與模型組相同。AG組:造模前10 min靜脈注射JAK2特異性抑制劑AG490(3 mg/kg)。處死大鼠后取得腦組織標本，測量其含水量;應用免疫組織化學和Western印跡方法檢測JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達。

1. 2. 2大鼠腦出血模型的制作10%水合氯醛300 mg/kg腹腔麻醉，俯臥位固定在成都泰盟DW-2000立體定向儀上，使門齒鉤平面比耳間線平面低2. 4 mm〔6〕。剪去頭部背側鼠毛，皮膚消毒，正中切開皮膚，長約15 mm，3%雙氧水腐蝕骨膜(用刀片刮去骨膜)，暴露前后囟門及冠狀縫，于冠狀縫前0. 2 mm，中線右側旁開3 mm處鉆一直徑約1 mm的小孔，不傷及硬腦膜〔7〕。將大鼠腹部翻轉，于鼠尾根部腹側正中消毒后做一2～3 mm切口，使用玻璃分針擴大至1 cm切口，分離暴露尾動脈并剪斷，待血液流出后，棄去第一滴血液，用微量進樣器吸取60 μl血液，將其固定于立體定向儀上，調整滑桿，沿鉆孔方向垂直進針，深度6 mm為注射點(尾狀核)。先緩慢注射10 μl，停針約2 min(此期間可加壓包扎好尾動脈)，然后緩慢勻速(10～17 μl/min，針芯旋轉推注)注射剩余血液，注射時間約3～5 min，注射后留針20 min，骨蠟封住顱孔，縫合皮膚切口并消毒，預防局部感染。

1. 2. 3大鼠神經學評分〔8〕神經癥狀觀察參照Longa 5級評分法，在大鼠處死前進行神經功能缺損評分。

1. 2. 4標本的采集各組大鼠在3、9 h、1、3、5、7 d相應時間點處死。處死前經腹注射10%水合氯醛。待麻醉后，將大鼠固定在實驗架上，迅速開胸，充分暴露出心臟，經左心室插入吊針針頭至升主動脈;右心耳處剪一缺口，將250 ml生理鹽水進行全速灌注，再用4%多聚甲醛250 ml進行灌注，待肝脾發硬，立即斷頭取腦。取得標本處理后繼續于4%多聚甲醛中固定24 h，脫水、包埋，連續冠狀位切片，恒溫切片機連續切片，片厚5 μm，行免疫組化檢測; JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3染色結果的判定使用二級計分法計數陽性細胞，在裝有目鏡網格測微尺的光學顯微鏡200倍視野下隨機選取5個視野，計數500個細胞，根據陽性細胞比例及陽性著色強度，按Shimizu等〔9〕采用的評分標準進行:以陽性細胞數＜5%、5%～24%、25%～50%、51%～74%及≥75%，分別判定為0、1、2、3、4分;每張切片陽性細胞的著色強度按無著色、淡黃色、棕黃色和棕褐色分別判定為0、1、2、3分;根據兩項積分之和判定結果，0分為陰性(－)，1分～2分為弱陽性(+)，3分～5分為中等陽性()，6分～7分為強陽性()。3只用來做Western印跡檢測，大鼠直接處死，迅速斷頭取腦，留取右側損傷腦組織，放入－80℃冰箱中凍存。

1. 2. 5腦組織含水量的測定取右側大腦進針處前、后0. 6 cm的腦組織，使用濾紙吸盡其表面水分，置于錫箔紙上，放在電子天平上秤出濕重，置入110℃恒溫烘箱內烤48 h后秤其干重，計算腦組織的含水量:大鼠腦組織含水量=(大鼠腦組織濕重－大鼠腦組織干重)/大鼠腦組織濕重×100%。

1. 2. 6 Western印跡檢測組織塊破碎后(冰上操作)，加入RIPA裂解液勻漿處理，煮沸變性留取上清液待用。配制8%分離膠和4%濃縮膠，取樣品上樣，進行SDS-PAGE電泳。恒流0. 11～0. 2A，轉移2～4 h，電轉完成后，將PVDF膜上含有蛋白Marker的條帶切下，于麗春紅S染液中進行反應，10～20 min，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。抗體4℃過夜。棄掉第一抗體溶液，TBST漂洗轉印膜，15 min×4次，加入二抗，作用1 h。免疫反應條帶用化學發光系統進行檢測，測定磷酸化JAK2、STAT3和總JAK2、STAT3蛋白的表達水平，X線進行照相記錄，β-actin作為內參照。用Quantity One軟件測蛋白條帶積分灰度值，以各組蛋白表達量與β-actin內參照的比值進行半定量分析。

1. 3統計學方法采用SPSS16. 0軟件進行方差分析、單因素方差分析。

2　結果

2. 1大鼠腦組織含水量S組中大鼠右側腦組織標本含水量為(71. 15±0. 02)%;與S組相比，M組中大鼠右側腦組織標本含水量明顯增高(P＜0. 05)，3 d時達到高峰，直到7 d含水量仍然較高(P＞0. 05);與M組相比，AG組中大鼠右側腦組織標本中含水量明顯減少(P＜0. 05)(表1)。

表1　各組大鼠中腦組織標本含水量測定結果(%，x±s，n=6)

2. 2免疫組織化學檢測各組中JAK2、STAT3蛋白均為陽性表達，表達于細胞質和細胞核中(圖1、圖2)，陽性細胞計數的差別無統計學意義(P＞0. 05); S組和AG組中p-JAK2、p-STAT3蛋白表達為陰性或弱陽性; M組中p-JAK2、p-STAT3蛋白為陽性表達，p-JAK2主要表達于細胞質，p-STAT3主要表達于細胞核，胞質少量表達(圖3)，且p-JAK2和p-STAT3蛋白在24 h呈強陽性表達，陽性細胞計數最多(圖4)。

圖1　大鼠JAK2免疫組化結果

圖2　大鼠STAT3免疫組化結果

圖3　大鼠p-JAK2和p-STAT3免疫組化結果(×400)

圖4　 24 h p-JAK2和p-STAT3免疫組化結果(×200)

2. 3 Western印跡檢測S組、AG組和M組JAK2蛋白水平相當(圖5);并且隨著時間的推移，其表達量也較恒定。S組、AG組和M組STAT3蛋白水平相當(圖6)，且表達量隨時間推移變化不顯著。

S組和AG組中大鼠腦組織p-JAK2和p-STAT3均表達為陰性，M組p-JAK2蛋白呈陽性表達，于1 d后蛋白表達量最大，與p-STAT3蛋白表達量存在一致性(圖7，表2)。

表2　 M組大鼠腦組織p-JAK2、p-STAT3表達水平比較(x±s)

圖5　各組AG組中大鼠腦組織JAK2蛋白表達情況

圖6　各組大鼠腦組織STAT3蛋白表達情況

圖7　 M組大鼠腦組織p-JAK2、p-STAT3蛋白表達

3　討論

JAKs/STATs是近年來發現的由細胞外到細胞內起作用的信號轉導通路，該通路包括JAK蛋白家族和STAT蛋白家族。JAK蛋白家族包括JAK1、JAK2、JAK3和Tyk2 4個成員，STAT蛋白家族成員在哺乳動物中已被克隆出的有以下7種: STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6，并且JAK是STAT上游的共有激酶〔10〕。目前研究認為該信號通路的作用途徑大致為:胞外可溶性信號分子(炎性因子、細胞因子、生長因子)能夠識別膜上的特異性受體，并與之結合，隨之信號分子與特異性受體結合發生二聚化，并能相互磷酸化，在細胞質內形成對JAKs蛋白具有高親和性的結合位點; JAKs蛋白與結合位點融合一起后，誘使酪氨酸磷酸化而活化，活化后的JAKs蛋白在細胞質內募集信號分子并識別STATs家族蛋白中的SH2功能結構域，誘使STAT蛋白磷酸化而活化;活化后的STATs家族蛋白之間可彼此形成同源或異源性二聚體并定向移動到細胞核內，與靶基因上游的啟動子相結合，進而直接激活靶基因，使其得以活化而表達，完成特異性信號分子受體介導的信號傳導過程，表達相應的生物學效應。目前已知有多種細胞因子(如IFN、IL-4、IL-6)和生長因子(如ECF、CSF、EPO)能夠通過活化JAK-STAT信號轉導途徑來進行轉導，不同的受體亞家族可分別通過特定的JAK和STAT蛋白分子進行信號轉導，該途徑已成為信號分子完成信息轉導的一條重要通道〔11〕。已有研究表明氧化應激反應也能激活JAK-STAT信號通路〔12〕。

近年來的研究發現JAK-STAT信號轉導通路不僅廣泛參與細胞應激反應、增殖分化、生長及凋亡，而且可能與炎癥、缺血等中樞神經疾病緊密相關，更重要的是可參與介導多種病理過程中炎癥反應和免疫反應的發生〔13〕。因此國內外的研究學者對以此信號轉導通路作為靶途徑研究進而研發出新型的靶向治療方法產生了極其濃厚的興趣〔14，15〕。研究還發現，JAK2-STAT3通路是一條細胞因子對機體免疫反應、神經系統和胚胎組織發育的調節以及細胞分裂、分化和凋亡等具有多重效應的信號轉導通路。那么JAK2/STAT3通路作為重要的細胞外到細胞內信號分子起作用的傳導通路，廣泛參與了細胞應激、分裂、生長、分化和調亡等多種生物學效應，并可被細胞外多種因子(炎性因子、生長因子等)和環境應激等激活，進而介導細胞分裂、分化以及增殖、凋亡等信號的轉導。然而它是否參與調控腦出血后周圍組織損傷過程，而阻斷此信號通路又有何影響，如何發生變化，對這些問題國內、外尚未見研究報道。

給予AG490干預后，大鼠腦組織含水量減少，提示腦水腫較輕，且p-JAK2和p-STAT3的表達也被抑制，對腦組織應有一定保護作用。可能是由于AG490抑制劑阻斷了JAK2-STAT3這一信號通路后所起的作用，據此可以推測JAK2-STAT3信號轉導通路參與了腦出血后周圍組織的損傷過程，并導致腦組織水腫。AG490作為一種JAK2特異性抑制劑，在很多研究實驗中都被應用。已有研究表明，在應用AG490這種JAK2抑制劑后，能明顯抑制腦組織損傷后p-JAK2、p-STAT3蛋白的表達，減輕大腦神經細胞損傷，改善神經組織功能缺損〔16〕，并與鄧必高等〔17〕研究結果相一致。p-JAK2和p-STAT3表達水平的降低，能減輕腦水腫，在一定程度上發揮腦保護作用。

本實驗結果顯示大鼠腦出血后周圍損傷腦組織中p-JAK2、p-STAT3表達含量隨時間推移逐漸增多，提示可能是由于應激或內環境的變化導致了JAK2-STAT3信號通路的激活，進而參與腦出血后周圍組織損傷的病理生理變化。由于應用JAK2蛋白抑制劑后，腦組織水腫有所減輕，并且p-JAK2和p-STAT3蛋白含量減少，提示可能是由于JAK2和STAT3的磷酸化引發腦組織水腫，但具體作用機制尚不清楚，有待于進一步研究。

4參考文獻

1 Saravavanan S，HairulⅣ，Prakash BN，et al．Swertiamarin attenuates inflammation mediators via modulating NF-κB/ⅠκB and JAK2/STAT3 transcription factors in adjuvant induced arthritis〔J〕．Eur J Pharm Sci，2014; 56: 70-86.

2 Stechishin OD，Luchman HA，Ruan YB，et al．On-target JAK2/STAT3 inhibition slows disease progression in orthotopic xenografts of human glioblastoma brain tumor stem cells〔J〕．Neuro Oncol，2013; 15(2): 198-207.

3 Wang ZF，Li Q，Liu SB，et al．Aspirin-triggered Lipoxin A4 attenuates mechanical allodynia in association with inhibiting spinal JAK2/STAT3 signaling in neuropathic pain in rats〔J〕．Neuroscience，2014; 273: 65-78.

4 Slattery ML，Lundgreen A，Kadlubar SA，et al．JAK/STAT/SOCS-signaling pathway and colon and rectal cancer〔J〕．Mol Carcinog，2013; 52(2): 155-66.

5 Liu XX，Zhang XJ，Zhang J，et al．Diosmin protects against cerebral ischemia/reperfusion injury through activating JAK2/STAT3 signal pathway in mice〔J〕．Neuroscience，2014; 268: 318-27.

6 Paxinos G，Watson CR. The rat brain in stereotaxic coordinates〔M〕．5th ed. New York: Academic Press，2005: 42.

7 Hua Y，Schallert T，Keep RF，et al．Behavioral tests after intracerebral hemorrhage in the rat〔J〕．Stroke，2002; 33(10): 2478-84.

8 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al．Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕．Stroke，1989; 20(1): 84-91.

9 Shimizu M，Saitoh Y，Itoh H. Immunohistochemical staining of Ha-ras oncogene product in normal，benign，and malignant human pancreatic tissues〔J〕．Hum Pathol，1990; 21(6): 607-12.

10薛廣才，梁德剛，魏民新，等. miRNA-21與JAK2-STAT3通路在心肌缺血后處理保護心肌中的相互影響〔J〕．天津醫藥，2013; 41(5): 451-4.

11 Campbell IL. Cytokine-mediated inflammation，tumorigenesis，and disease-associated JAK/STAT/SOCS signaling circuits in the CNS〔J〕．Brain Res Brain Res Rev，2005; 48(2): 166-77.

12 Kuo DY，Chen PN，Hsieh YS. Targeting oxidative stress in the hypothalamus: the effect of transcription factor STAT3 knockdown on endogenous antioxidants-mediated appetite control〔J〕．Arch Toxicol，2015; 89(1): 87-100.

13 Park DW，Lyu JH，Kim JS，et al．Role of JAK2-STAT3 in TLR2-mediated tissue factor expression〔J〕．J Cell Biochem，2013; 114(6): 1315-21.

14 Vijayakrishnan L，Venkataramanan R，Gulati P. Treating inflammation with the janus kinase inhibitor CP-690，550〔J〕．Trends Pharmacol Sci，2011; 32(1): 25-34.

15 Quintas-Cardama A，Kantarjian H，Cortes J，et al．Janus kinase inhibitors for the treatment of myeloproliferative neoplasias and beyond〔J〕．Nat Rev Drug Discov，2011; 10(2): 127-40.

16 Morga E，Mouad-Amazzal L，Felten P，et al．Jagged1 regulates the activation of astrocytes via modulation of NFκB and JAK/STAT/SOCS pathways〔J〕．Glia，2009; 57(16): 1741-53.

17鄧必高，但伶，黃燕.異丙酚對大鼠內毒素腦損傷磷酸化JAK2、STAT3表達的影響〔J〕．中國醫院藥學雜志，2011; 31(22): 1867-70.

〔2015-07-27修回〕

(編輯曲莉)

The mechanisms of JAK2-STAT3 signaling pathway in intracerebral hemorrhage models of rats

WANG Xu-Chang，ZHANG Zhen-Xing，SONG Xiao-Feng，et al．
Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，Liaoning，China

【Abstract】Objective To investigate the role and mechanisms of JAK2-STAT3 signaling pathway preliminarily in intracerebral hemorrhage rat model and the relationship between brain edema．Methods 108 healthy male SD rats were used to induce intracerebral hemorrhage models．According to the difference of bleeding time，all rats were randomly divided into six groups．Every group was further divided into three subgroups: model(M)，sham(S)and AG490(AG)groups．Both immunohistochemistry and Western blot analysis were used to detect the expressions of JAK2，p-JAK2，STAT3 and p-STAT3．Results Compared with those of sham and AG groups，the protein levels of p-JAK2 and p-STAT3 were significantly increased in M group and peaked at 24 h．Compared with that of model group，the water content of rat brain tissues in AG group were lower than that in M group at every time point．Conclusions The JAK2-STAT3 signaling pathway could be activated in intracerebral hemorrhage rat model and contributes to brain edema．

【Key words】JAK2; STAT3; Intracerebral hemorrhage

通訊作者:張振興(1974-)，男，博士，副主任醫師，碩士生導師，主要從事腦血管疾病的基礎和臨床研究。

基金項目:遼寧省高等學校杰出青年學者成長計劃(No．LJQ2013088)

〔文章編號〕1005-9202(2015)20-5708-04;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 012

〔文獻標識碼〕A

〔中圖分類號〕R743. 34