破壁靈芝孢子粉對(duì)裸鼠移植性人乳腺癌的抑制作用

謝　明譚玉林　張　偉　何漢江趙文健資　源郭皖北(湘南學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部病理研究所，湖南　郴州　420000)

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破壁靈芝孢子粉對(duì)裸鼠移植性人乳腺癌的抑制作用

謝明1譚玉林張偉何漢江1趙文健1資源1郭皖北
(湘南學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部病理研究所，湖南郴州420000)

〔摘要〕目的觀察破壁靈芝孢子(GLS)粉對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞移植瘤生長增殖作用和TMSG-1 mRNA表達(dá)的影響。方法建立人乳腺癌MCF-7細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，把30只成瘤裸鼠隨機(jī)分為五組，每組6只，分別為不同劑量破壁GLS組(1. 5、3、4. 5 g/kg)、磷酰胺(CTX)模型組、生理鹽水組。用藥4 w后觀察破壁靈芝孢子粉對(duì)裸鼠移植瘤體積、瘤重的影響，并計(jì)算抑制率;用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)測(cè)定細(xì)胞增殖周期和細(xì)胞凋亡水平;用半定量RT-PCR檢測(cè)腫瘤組織中TMSG-1 mRNA的表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組比較，中劑量和高劑量破壁GLS組(3、4. 5 g/kg)、模型組的移植瘤重瘤體積與對(duì)照組比較顯著減少(P＜0. 05)，中劑量、高劑量破壁GLS組和模型組的腫瘤抑制率分別為36. 7%、44. 5%、54. 2%;用藥4 w后，癌細(xì)胞S期和G2/M期細(xì)胞所占比例下降，相應(yīng)的G0/G1期細(xì)胞增加，藥物抑制了細(xì)胞的正常增殖，凋亡實(shí)驗(yàn)顯示藥物組細(xì)胞凋亡率增加，藥物組總體凋亡率高于對(duì)照組(P＜0. 05或P＜0. 01); RT-PCR結(jié)果，破壁GLS組(1. 5、3、4. 5 g/kg)可使TMSG-1 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，與生理鹽水組比較顯著增加(P＜0. 05或P＜0. 01)。結(jié)論破壁GLS粉具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，同時(shí)上調(diào)MCF-7細(xì)胞裸鼠移植瘤組織中TMSG-1 mRNA的表達(dá)發(fā)揮潛在的抗腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用。

〔關(guān)鍵詞〕裸鼠人乳腺癌移植瘤;破壁靈芝孢子粉; TMSG-1 mRNA;半定量RT-PCR

1免疫學(xué)重點(diǎn)學(xué)科

第一作者:謝明(1962-)，女，教授，副主任醫(yī)師，主要從事乳腺腫瘤病理學(xué)研究。

靈芝孢子(GLS)是靈芝生長成熟期從菌蓋彈射出來的極其細(xì)小的顆粒。它是靈芝的生殖細(xì)胞，具有靈芝的全部遺傳活性物質(zhì)，富含蛋白質(zhì)和氨基酸類、糖肽類、三萜類物質(zhì)〔1〕。研究表明，GLS粉具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、保腎護(hù)肝、降糖降脂和延緩衰老等功效〔2，3〕。腫瘤的轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因，目前控制腫瘤轉(zhuǎn)移是研究乳腺癌研究的重點(diǎn)，乳腺癌轉(zhuǎn)移抑制基因TMSG-1(也稱Rabbit Anti-LASS2)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散的基因〔4〕。本研究觀察不同濃度破壁GLS粉對(duì)人乳腺癌裸鼠移植瘤治療效果和對(duì)移植瘤組織中TMSG-1蛋白和mRNA表達(dá)的影響。

1　材料與方法

1. 1材料雌性Balb/C小鼠35只，4～6周齡，體重20～22 g，購自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部，裸鼠生產(chǎn)許可證號(hào): SCXK(湘)2011-0003，使用許可證SYXK(湘)2011-0001。在SPF條件下飼養(yǎng)于中南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部。人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞由本校化學(xué)和生命科學(xué)系實(shí)驗(yàn)室提供;破壁GLS粉膠囊購于上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院茹寶食用菌有限公司(破壁率＞99%)，GLS粉為棕色粉末，體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)前取膠囊內(nèi)容物于研缽中研磨，用0. 5% CMC-Na配制成不同濃度，高壓滅菌。乳腺癌化療藥物磷酰胺(CTX)由江蘇恒瑞制藥有限公司生產(chǎn)。DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶和多孔細(xì)胞培養(yǎng)板等均購自杭州都俊生物有限公司。RT-PCR盒(Promega公司)，低溫高速離心機(jī)(天津市泰新特儀器有限公司)，PCR儀(德國Eppendorf公司)。

1. 2方法

1. 2. 1細(xì)胞培養(yǎng)和單細(xì)胞懸液的制備細(xì)胞株MCF-7復(fù)蘇后置于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，適時(shí)傳代。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)0. 25%胰蛋白酶消化后吹打成單細(xì)胞懸液，600 r/min離心5 min，用無菌PBS重懸細(xì)胞并將細(xì)胞的濃度調(diào)至為5×1010/ml，將細(xì)胞懸液分裝于5 ml無菌西林瓶中備用。

1. 2. 2動(dòng)物模型建立、動(dòng)物分組及給藥方法用1 ml注射器注射0. 1 ml的上述細(xì)胞懸浮液于每只裸鼠的右腋皮下。接種10 d后，可見接種處微小隆起，并逐漸增大。35只裸鼠中有30只出現(xiàn)腫塊，接種成功率為86%。把30只移植瘤接種成功的裸鼠隨機(jī)分成5組，每組6只。接種26 d瘤體組織達(dá)到1 cm3左右時(shí)將破壁靈芝孢子粉溶液三組:低劑量GLS組1. 5 g/kg灌胃，1次/d，中劑量GLS組3 g/kg灌胃，1次/d，高劑量GLS組4. 5 g/kg灌胃，1次/d，連續(xù)4 w; CTX模型組: CTX 30 mg/kg，腹腔注射，1次/w，連續(xù)4 w;生理鹽水組:每天灌服相同體積的生理鹽水，腹腔注射相同體積的生理鹽水。

1. 2. 3觀察裸鼠成瘤情況用藥后觀察裸鼠的一般狀況，包括日常活動(dòng)、精神狀態(tài)、體重變化。每3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長徑(a)和短徑(b)，計(jì)算腫瘤體積(V)，V= ab2/2。藥物處理4 w后，脫頸椎處死裸鼠，完整剝離腫瘤，并稱量重量和測(cè)量瘤體的體積。計(jì)算抑制率:抑制率=(1－實(shí)驗(yàn)組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重)×100%。

1. 2. 4 RT-PCR檢測(cè)TMSG-1 mRNA的表達(dá)分別選取對(duì)照組、1. 5、3及4 g/kg GLS粉溶液組裸鼠腫瘤組織約100 mg制備勻漿。收集細(xì)胞，按照Trizol一步法提取MDA-MB-231細(xì)胞總RNA，取1 μg RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶在下列條件下合成cDNA: 25℃5 min，40℃60 min，75℃15 min。然后用該cDNA作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。所有引物均由北京賽百勝基因技術(shù)公司合成。TMSG-1(134 bp)上游引物: 5'-TCCTGCCTTCTTTGGCTATTACTT-3';下游引物: 5'-TGCGTTCATCTTCTACCAGCTTTC-3'。用GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)量為內(nèi)參照(234 bp)上游引物: 5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTCT-3';下游引物: 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。擴(kuò)增條件如下: 94℃2 min，94℃40 s、55℃60 s、72℃40 s進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min終止反應(yīng)。將TMSG-1和GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠圖像分析系統(tǒng)行吸光度掃描半定量，測(cè)出TMSG-1與內(nèi)參照GAPDH吸光度掃描值之比作為評(píng)價(jià)TMSG-1 mRNA表達(dá)水平的指標(biāo)。

1. 2. 5流式細(xì)胞儀檢測(cè)裸鼠移植瘤癌細(xì)胞細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)取每只裸鼠的新鮮瘤體組織1～2 mm3，在200目不銹鋼篩網(wǎng)上制成單細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，用預(yù)冷的75%乙醇固定，再用PBS將細(xì)胞濃度調(diào)成1×106/ml。碘化丙啶(PI)染色，4℃避光染色30 min。按細(xì)胞周期測(cè)試盒操作程序測(cè)定細(xì)胞周期，按細(xì)胞凋亡測(cè)試盒操作程序分析細(xì)胞凋亡率，分析細(xì)胞周期分布情況及凋亡細(xì)胞所占的比例。

1. 3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS19. 0軟件行Dunnett及LSD檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2. 1裸鼠體內(nèi)乳腺癌移植瘤生長的影響接種癌細(xì)胞10 d后，接種處可見微小突起，以后逐漸變大。35只裸鼠中30只先后出現(xiàn)腫塊，接種成功率為87%。癌細(xì)胞接種3 w后，30只裸鼠移植瘤長徑增至1. 0 cm左右。藥物處理后，各組移植瘤繼續(xù)生長，以中劑量和高劑量的破壁GLS粉溶液組生長較慢，與生理鹽水組之間移植瘤生長抑制率均有顯著差異(P＜0. 05)。腫瘤體積比較顯示，CTX模型組、中、高劑量破壁GLS組與生理鹽水組比較有顯著差異(P＜0. 01)，見表1。

表1　破壁GLS粉對(duì)裸鼠皮下移植瘤生長的抑制作用(x ±s，n=6)

2. 2破壁GLS粉對(duì)TMSG-1 mRNA表達(dá)的影響RT-PCR檢測(cè)顯示，裸鼠移植瘤經(jīng)不同濃度破壁GLS粉作用4 w后，TMSG-1 mRNA的表達(dá)增加(圖1)。對(duì)照組OD值為0. 011 7± 0. 051，低、中、高劑量GLS組分別為0. 593 0±0. 207 5，0. 630 6± 0. 165 4，0. 635 12±0. 158 9，破壁GLS粉均高于生理鹽水組(P＜0. 01)。但中、高劑量GLS組上調(diào)TMSG-1 mRNA的表達(dá)狀況很相似。

2. 3各組裸鼠移植瘤細(xì)胞凋亡的情況不同濃度破壁GLS粉溶液組(1. 5 g/kg、3 g/kg、4. 5 g/kg)作用移植瘤4 w后，F(xiàn)CM-7細(xì)胞的S期和G2/M期下降，相應(yīng)G0/G1期增加。表明細(xì)胞用藥后DNA復(fù)制和分裂活動(dòng)減弱，藥物抑制了細(xì)胞周期的正常活動(dòng);經(jīng)不同處理的五組細(xì)胞，用藥組總體凋亡率高于對(duì)照組，模型組、中、高劑量GLS組凋亡率〔(29. 12±5. 23)%、(23. 27± 5. 09)%、(25. 77±1. 06)%〕與對(duì)照組、低劑量GLS組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔(6. 29±1. 07)%、(16. 29±3. 32)%，P＜0. 05〕。

圖1　 RT-PCR檢測(cè)破壁GLS對(duì)裸鼠移植瘤TMSG-1 mRNA表達(dá)的影響

3　討論

TMSG-1在正常人體各組織中均有表達(dá)，尤其是在肝臟和腎臟。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到在正常乳腺組織有高表達(dá)，通過細(xì)胞免疫組化和組織免疫組化染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中，少量細(xì)胞核著染。這與馬春樹等〔5〕研究表示TMSG-1表達(dá)主要在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜系統(tǒng)是一致的，細(xì)胞核著染可能與TMSG-1擁有具有轉(zhuǎn)錄因子功能的同源異型結(jié)構(gòu)域有關(guān)〔5〕。唐寧等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)同源基因LASS-2在PCMV-HA2-ASS2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HCCLM3細(xì)胞中高表達(dá)，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，抑制其生長。Mizutani等〔7〕發(fā)現(xiàn)TMSC-1對(duì)神經(jīng)酰胺的合成也有影響，而神經(jīng)酰胺能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔8〕，表明TMSG-1蛋白的高表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，破壁靈芝孢子粉對(duì)淋人乳腺癌移植瘤具有一定的抑制作用，近年來對(duì)GLS抗腫瘤作用研究廣泛，但其作用機(jī)制尚不清楚，國內(nèi)外對(duì)破壁靈芝孢子粉抗腫瘤機(jī)制研究包括以下幾方面:免疫抗腫瘤作用〔9，10〕，抑制腫瘤血管形成〔11，12〕，抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移〔13〕，GLS抗腫瘤作用還可能與抑制TOPⅠ，TOPⅡ異構(gòu)酶，抑制腫瘤細(xì)胞端粒酶有關(guān)〔14〕。陳娟等〔14〕證實(shí)腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制是通過上調(diào)凋亡基因Bax mRNA，下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2和Bclxl mRNA的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，本研究用RT-PCR技術(shù)顯示破壁GLS粉還能夠明顯上調(diào)乳腺癌細(xì)胞TMSG-1 mRNA的表達(dá)，降低腫瘤轉(zhuǎn)移性。目前臨床腫瘤開展的靶向治療藥物存在有效率低、副作用大、價(jià)格高等局限，而中醫(yī)藥抗腫瘤素有“簡、便、廉”，中醫(yī)藥治療能夠有效全面改善與調(diào)節(jié)患者的軀體癥狀，具有整體、多靶點(diǎn)的療效特點(diǎn)，成了國內(nèi)外學(xué)者爭相研究的熱點(diǎn)。因此應(yīng)用中藥治療腫瘤轉(zhuǎn)移具有一定優(yōu)勢(shì)。隨著研究的深入，破壁GLS粉的安全性、功能和作用機(jī)制將逐漸了解清楚，破壁GLS粉將會(huì)有廣闊的應(yīng)用前景。

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〔2014-06-18修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)

通訊作者:郭皖北(1962-)，男，教授，博士，主要從事中西醫(yī)內(nèi)分泌疾病治療研究。

基金項(xiàng)目:湖南省教育科學(xué)“十二五”規(guī)劃2011年度省級(jí)課題(No．XJK011CGD038);郴州市科技局立項(xiàng)課題(郴財(cái)教指〔2011〕35號(hào));湘南學(xué)院免疫學(xué)重點(diǎn)建設(shè)學(xué)科項(xiàng)目(xnxymy2012-125)

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2015)20-5728-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 020

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔中圖分類號(hào)〕R737. 9