成纖維細胞/膠原凝膠復合支架促進中耳黏膜上皮細胞的增殖

于姝媛　王　蘋　湯　勇劉柏林李曉峰(吉林大學第一醫院耳鼻咽喉-頭頸外科，吉林　長春　3002)

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成纖維細胞/膠原凝膠復合支架促進中耳黏膜上皮細胞的增殖

于姝媛王蘋湯勇1劉柏林1李曉峰1
(吉林大學第一醫院耳鼻咽喉-頭頸外科，吉林長春130021)

〔摘要〕目的探討植入成纖維細胞的膠原凝膠復合支架對中耳黏膜上皮細胞生長和增殖的影響。方法制備大鼠I型膠原凝膠，以7∶1∶1混合膠原、10×DMEM和新生牛血清。以1/9體積比接種成纖維細胞，構建成纖維細胞的膠原凝膠復合支架，冰凍切片觀察成纖維細胞在凝膠中的生長形態。復合支架接種中耳黏膜上皮細胞，共聚焦顯微鏡觀察成纖維細胞與上皮細胞的生長狀態，酶消化計數上皮細胞在接種的不同時間點，細胞數量的變化。結果接種后3 d成纖維細胞數量逐漸增加，細胞的突起在兩極逐漸伸展延長。冰凍切片結果顯示，成纖維細胞均勻地分布于凝膠中，細胞兩極為兩個較長的突起。接種于成纖維細胞/膠原凝膠復合支架上皮細胞增殖速度明顯高于接種于單純膠原凝膠組，比較上皮細胞在復合支架接種后3 d，6 h的細胞數量明顯多于同時間點的膠原凝膠組(P＜0. 05，P＜0. 01)。共聚焦顯微鏡觀察發現，上皮細胞在單純膠原凝膠中，集聚生長形成島型分布，在成纖維細胞/膠原復合支架上，與成纖維細胞交互分布，且細胞密度大于前者。結論植入成纖維細胞的膠原凝膠復合支架對上皮細胞增殖有明顯的促進作用。

〔關鍵詞〕膠原凝膠;成纖維細胞;上皮細胞;復合支架

1吉林省人民醫院耳鼻咽喉-頭頸外科

第一作者:于姝媛(1986-)，女，技士，主要從事耳科學研究。

鼓膜穿孔是耳科常見的疾病之一，常由外傷和化膿性中耳炎遷延所致。鼓膜穿孔可引起聽力下降、言語發育延遲和慢性耳瘺及膽脂瘤形成等〔1〕。目前常用的治療方法是外科鼓膜修補，修補材料大多來自自體顳肌筋膜或顳骨骨膜，盡管近期的手術成功率比較高，但由于修補材料與鼓膜組織結構尚存在差異，其主要差異是修補材料缺少纖維層;此外，自體材料存在來源不足和機體的再損傷等原因，使鼓膜功能恢復和遠期效果不理想〔2〕。目前組織工程皮膚的研究進展使應用此技術修復鼓膜缺損成為可能，本實驗利用不斷完善的組織工程學技術及支架材料的開發，探索構建組織工程化鼓膜的技術，研制組織工程化鼓膜移植物，以實現提高鼓膜穿孔治愈率、提高聽力功能恢復和遠期療效以及減輕對患者自身機體損傷的目標。

1　材料和方法

1. 1動物和主要實驗試劑Wistar大鼠(清潔級)由吉林大學動物部(動物飼養合格證號: 10-1026)提供。隨機選取耳廓反射正常，實驗前清潔外耳道，顯微鏡下檢查均無中耳炎的動物，確保動物無噪聲暴露及藥物使用史。胎牛血清(FBS)、DMEM/F12培養基、胰蛋白酶、表皮生長因子(EGF)、Cell Tracker Dil等購于Invitrogen公司，CK19和Vimentin抗體購于北京博奧森生物公司。藥房，2010; 21(15): 1439-40.

1. 2中耳黏膜上皮細胞和成纖維細胞的分離培養方法參照Formanek等〔3〕文獻。采用10%水合氯醛按300 mg/kg劑量，腹腔注射進行大鼠麻醉。剪開顱骨，取出聽泡，立即浸入含抗生素、預冷的D-Hank液中。無菌環境置聽泡于解剖顯微鏡下打開，用分離針剝離中耳黏膜。將黏膜移入0. 075%蛋白酶ⅩⅣ消化液中，室溫下消化1 h，移入離心管，1 000 r/min下離心10 min，棄去上清，留取細胞沉淀。用上皮細胞培養基懸浮細胞，活細胞染色并細胞計數，調整細胞含量為5×105/ml，接種于35 mm直徑的培養皿內。培養1 h后，將未貼壁的細胞移入另一個培養皿中，加入2 ml上皮細胞培養液(含10%FBS和20 ng/ml EGF的DMEM/F12)，剩余細胞加入成纖維細胞培養基(含10%FBS的DMEM/F12)。每日在倒置顯微鏡下觀察細胞形態。上皮細胞和成纖維細胞鑒定采用免疫熒光染色技術，CK19抗體識別上皮細胞，Vimentin抗體識別成纖維細胞。

1. 3膠原凝膠制備采用大鼠鼠尾膠原浸出法，成年大鼠鼠尾，酒精消毒，去除尾上皮膚，分離肌腱與肌肉;將肌腱在70%乙醇中浸泡30 min，切碎，無菌水沖洗;轉移至0. 1%乙酸溶液中，每根鼠尾用250ml乙酸溶液浸泡，置于4℃，48 h后取出，4 000 r/min離心30 min，取上清;加入0. 1 mol/L NaOH，按6∶1體積比混合，中和乙酸，然后1 500 r/min離心5 min，收獲沉淀;等體積稀乙酸(0. 01 mol/L)溶解沉淀，4℃保存。

1. 4成纖維細胞膠原凝膠的制備取第3代成纖維細胞，在處于對數生長期90%細胞融合時用0. 25%的胰蛋白酶消化3 min，輕輕吹打，1 000 r/min離心，重懸于成纖維細胞培養液中，細胞計數，調整濃度至5×106/ml。用滅菌的0. 1 mol/L的醋酸溶液稀釋提取的鼠尾膠原濃度至0. 6%，然后與10×DMEM細胞培養液、新生牛血清按7∶1∶1的比例混勻;加入1 mol/L NaOH以中和醋酸，快速混勻，立即加入1/9劑量的成纖維細胞懸液，快速混合。將此膠原/細胞混懸液吸入培養皿;在37℃培養箱中靜置10 min，待凝膠形成后，補加成纖維細胞培養液，培養箱中培養。每3天換液1次。

1. 5冰凍切片成纖維細胞膠原凝膠進行冰凍切片，片厚10 μm左右。貼附于載玻片上，10%甲醛固定，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，進行蘇木素-伊紅(HE)染色。

1. 6細胞增殖實驗中耳黏膜上皮細胞采用Dil標記，以1× 105細胞/ml的濃度分別接種于膠原凝膠和成纖維細胞膠原凝膠復合支架上，持續培養，在培養后3、6 d時間點，消化細胞，熒光顯微鏡下計數紅色熒光標記的細胞數量。

1. 7統計學方法應用SPSS17. 0軟件進行單因素方差分析。

2　結果

2. 1中耳黏膜細胞一般形態和鑒定中耳黏膜上皮細胞，在接種后24 h，大部分細胞貼壁，5 d細胞增殖明顯，相互融合成島狀(圖1a)。培養到第8天時，呈現典型的鋪路石狀，與角朊細胞相似。細胞融合成片，鋪滿培養皿的底部(圖1b)。激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，培養6 d的中耳黏膜上皮細胞表達CK19標記蛋白，陽性表達定位于細胞質，見圖1c。綠色熒光為陽性表達，藍色熒光為核復染(Heochest33342)。

中耳黏膜成纖維細胞，1 h后既有貼壁細胞，細胞形態為長梭形，6 d細胞集落彼此融合接近長滿單層(圖1d)。10 d細胞交叉重疊生長，但長梭形的生長形態依然良好(圖1e)。采用波形蛋白(Vimentin)免疫熒光染色鑒定成纖維細胞，Vimentin陽性表達呈現紅色熒光，定位于細胞質。培養6 d的成纖維細胞均表達標志蛋白Vim。

圖1　形態學觀察中耳黏膜上皮和成纖維細胞

a～c:中耳黏膜上皮細胞，d～f:中耳黏膜成纖維細胞

2. 2成纖維細胞/膠原凝膠復合支架一般形態觀察膠原凝膠形成后呈半透明狀，隨時間延長，膠原凝膠發生收縮，培養基中放置12 d后，膠原凝膠收縮，且膠原彈性增加。成纖維細胞，接種后約3 h可見細胞與膠原纖維發生黏著。接種后3 d，成纖維細胞數量生長迅速，細胞呈長梭形，細胞的兩極逐漸伸展延長。膠原凝膠中可以見成纖維細胞極性排列。接種后12 d凝膠塊收縮至原來的3/5左右，此后收縮不明顯。大約3 w后，成纖維細胞密度達到其極限，部分成纖維細胞從膠原凝膠中遷出。冰凍切片結果顯示，HE染色可見膠原凝膠呈較均一的淡紅色網狀分布，而成纖維細胞均勻地分布于凝膠中，呈長梭形，胞核呈橢圓形，大多數細胞兩極為兩個較長的突起，極少數細胞有較多的突起。見圖2。

圖2　成纖維細胞/膠原凝膠復合支架的HE染色

2. 3中耳黏膜上皮細胞在成纖維細胞/膠原凝膠復合支架上增殖活性變化膠原凝膠接種成纖維細胞3 d后，在細胞/膠原凝膠復合支架上接種Dil染料標記的上皮細胞。分別在接種上皮細胞的3 d、6 d后，消化細胞，熒光顯微鏡下計數紅色熒光細胞的細胞數。結果顯示，接種于成纖維細胞/膠原凝膠復合支架上皮細胞增殖速度明顯高于接種于單純膠原凝膠組，比較上皮細胞在復合支架接種后3 d、6 h的細胞數量明顯多于同時間點的膠原凝膠組(P＜0. 05，P＜0. 01)。共聚焦顯微鏡觀察發現，上皮細胞在單純膠原凝膠中，集聚生長形成島型分布，在成纖維細胞/膠原復合支架上，與成纖維細胞交互分布，且細胞密度大于前者。見圖3。藍色熒光為Dapi標記的成纖維細胞，紅色熒光為Dil標記的上皮細胞，Bar=50 μm

圖3　成纖維細胞/膠原凝膠復合支架接種上皮細胞的激光共聚焦掃描結果(×200)

3　討論

鼓膜位于中耳鼓室和外耳道交界，是一個由上皮層、黏膜層和中間纖維層組成的半透明薄膜，具有增加傳入聲波增益的特殊傳音結構。鼓膜損傷導致穿孔常見的治療方法是外科修補，選用自體顳骨骨膜、顳肌筋膜或耳屏軟骨膜封閉穿孔，盡管手術修補的成功率較高，但由于修補材料與鼓膜組織結構存在差異(缺少纖維層)，鼓膜功能恢復和遠期療效不理想。由于鼓膜組織形成的特殊放射狀纖維支持鼓膜的強度及緊張度，而大部分的穿孔愈合是假膜愈合，即只有上皮層和黏膜層，缺少成纖維細胞形成的中間纖維層，假性鼓膜仍無法補償聲音傳入時所產生的衰減。這個實驗通過構建膠原/成纖維細胞符合支架，觀察組織工程鼓膜纖維層結構對黏膜上皮細胞生長和增殖的影響，構建具有纖維層的完整生物工程鼓膜。

生物工程材料在外科組織修復術中有廣泛的應用。如何根據損傷組織局部的組織學特征需用合適的工程材料是組織修復成功的關鍵。適合于鼓膜修復的工程材料首選考慮中間纖維層的形成，以保證修復成功后的鼓膜強度和適宜的緊張度。顧其勝〔4〕報道，膠原蛋白具有成纖維性能。本實驗證實凝膠中的成纖維細胞與膠原之間存在相互作用，有利于成纖維細胞的有序生長、增殖。成纖維細胞沿膠原纖維縱向排列，這種結構使得纖維細胞凝膠復合支架具有一定的伸展性和彈性。

Tremblay等〔5〕研究發現，利用含成纖維細胞和不含成纖維細胞的膠原、彈性蛋白生物工程復合物進行皮膚損傷修復，發現移植后含成纖維細胞的復合物降解速度要比不含成纖維細胞的慢2～4 w，證實植入的成纖維細胞可穩定真皮纖維層。成纖維細胞可分泌EGF等上皮生長因子，促進上皮細胞生長，而且膠原中成纖維細胞具有促真皮與表皮重組的作用。

文獻報道在體外培養時上皮細胞與成纖維細胞的相互作用是通過它們分泌在培養基中的可溶性酸性生長因子來實現的。成纖維細胞既能夠分泌胰島素樣生長因子(IGF-1)，也能合成Ⅰ、Ⅲ型膠原和纖維黏連蛋白(FN)，FN成分具有促進細胞向傷口處移動〔6〕，成纖維細胞在組織上與過程中的作用不可缺少。

在體外培養過程中，成纖維細胞沿膠原纖維重新排列，接種成纖維細胞12 d后凝膠塊收縮至原來的3/5左右。可能源于膠原凝膠中的成纖維細胞分泌Ⅰ和Ⅲ型膠原等細胞外基質，這些新分泌的基質成分使重組膠原凝膠發生纖維重構。此外，細胞外基質的增多可以改善膠原凝膠的生物相容性，重構的膠原凝膠改變了膠原凝膠的韌性，使復合支架更適合上皮細胞生長。Goulet等〔7〕通過成纖維細胞和上皮細胞間接共同培養的系統觀察成纖維細胞對上皮細胞生長的影響。結果發現，間接共培養系統明顯刺激上皮細胞的生長和增殖，上皮細胞克隆形成率增加，認為這個間接培養基中存在著由成纖維細胞所分泌的生長因子促進上皮細胞的增殖。Yoshikawa等〔8〕研究認為成纖維細胞可能還分泌一些其他類型與上皮細胞分化增殖信號傳導途徑的細胞基質成分，這在鼓膜修復過程中的作用尚待進一步證實。

綜上所述，在膠原凝膠中成纖維細胞具有活躍的生物學特性，使之形成有抗拉伸能力的組織工程類似鼓膜纖維層，在其表面成功接種的中耳黏膜上皮細胞具有促黏附和增殖作用，有望成為鼓膜修復的生物工程替代品。

4參考文獻

1 Hardman J，Muzaffar J，Nankivell P，et al．Tympanoplasty for chronic tympanic membrane perforation in children: systematic review and meta-analysis〔J〕．Otol Neurotol，2015; 36(5): 796-804.

2 Carr SD，Strachan DR，Raine CH. Factors affecting myringoplasty success 〔J〕．J Laryngol Otol，2015; 129(1): 23-6.

3 Formanek M，Millesi W，Willheim M，et al．Opitimized growth medium for primary culture of human oral keratinocytes〔J〕．Int J Oral Maxilofac，1995，35(5): 157-60.

4顧其勝.膠原蛋白的臨床應用〔J〕．中國修復重建外科雜志，2006; 20(10): 1052-8

5 Tremblay P，Cloutier R，Lamontagne J，et al．Potential of skinfi broblastsfor application to anterior cruciate ligament tissue engineering〔J〕．Cell Transplant，2011; 20(4): 535-42.

6 Froget S，Barthelemy E，Guillot F，et al．Wound healing mediator production by human dermal fibroblasts grown within a collagen-GAG matrix for skin repair in humans〔J〕．Eur Cytokine Netw，2003; 14(1): 60-4.

7 Goulet F，Poitras A，Rouabhia M，et al．Stimulation of human keratinocyte proliferation through growth factor exchanges with dermal fibroblasts in vitro〔J〕．Burns，1996; 22(2): 107-12.

8 Yoshikawa M，Kojima H，Yaguchi Y，et al．Cholesteatoma fibroblasts promote epithelial cell proliferation through overexpression of epiregulin〔J〕．PLoS One，2013; 8(6): e66725.

〔2014-11-23修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者:湯勇(1973-)，男，主任醫師，主要從事耳科學研究。

基金項目:吉林省自然科學基金項目(No．201015223);吉林省衛生計生委資助課題(No．2012z094)

〔文章編號〕1005-9202(2015)20-5703-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 021

〔文獻標識碼〕A

〔中圖分類號〕R764