熱休克蛋白90、缺氧誘導因子-1α在大腸癌中的表達及意義

任亞君　熊枝繁　曹仕瓊　熊莉娜　涂　艷張　芹熊　亮程漢英(華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院消化內科，湖北　武漢　40077)

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熱休克蛋白90、缺氧誘導因子-1α在大腸癌中的表達及意義

任亞君熊枝繁曹仕瓊熊莉娜涂艷1張芹2熊亮3程漢英
(華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院消化內科，湖北武漢430077)

〔摘要〕目的觀察熱休克蛋白90(HSP90)、缺氧誘導因子(HIF)-1α在大腸癌發生發展過程中的表達及意義。方法運用免疫組織化學法檢測HSP90，HIF-1α兩者在大腸癌及正常組織中的表達情況。結果HSP90、HIF-1α在正常大腸組織，大腸腺癌中的陽性率分別為: 30%、63. 0%; 15. 0%、71. 7%。兩者在正常組織和大腸腺癌中的表達差異均有統計學意義(P = 0. 013，P＜0. 001)。HSP90蛋白的表達與大腸癌組織的分化程度，Duke分期及是否有淋巴結轉移有關(P＜0. 05)，HIF-1α的表達與Duke分期及是否有淋巴結轉移有關(P＜0. 05);通過相關性分析，兩者具有明顯相關性(P＜0. 01)。結論HSP90，HIF-1α可能與大腸腺癌的發生、浸潤及轉移有關;兩者的協同作用可能參與了大腸癌的發生發展。

〔關鍵詞〕大腸癌;熱休克蛋白(HSP)90;缺氧誘導因子(HIF)-1α;免疫組織化學

1華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院老年病科

2華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院病理科

3華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院檢驗科

第一作者:任亞君(1987-)，女，在讀博士，主要從事細胞因子與消化道腫瘤的關系研究。

大腸癌近年來發病率有增高的趨勢〔1〕。熱休克蛋白(HSP)90，對血管形成，腫瘤的侵襲轉移，腫瘤細胞增殖，細胞周期進程及凋亡的信號轉導通路中多種致癌蛋白的構象、穩定性及功能的維持均很重要〔2〕。缺氧誘導因子(HIF)-1α，對腫瘤的血管再生，糖酵解代謝及腫瘤的侵襲性均有調節作用〔3～5〕。本研究通過免疫組織化學SABC法檢測大腸癌組織中HSP90及HIF-1α的表達，觀察兩者與大腸癌臨床病理特征的關系，探討兩者在大腸癌發生發展及侵襲轉移過程中的作用。

1　資料與方法

1. 1一般資料選取華中科技大學同濟醫學院附屬協和、梨園醫院2004年1月至2012年10月病理科存檔石蠟包埋組織及2012年10月至2013年1月期間手術切除的新鮮大腸癌組織，所有病例術前均未行放化療，術后均經病理證實。大腸腺癌46例，男28例，女18例;年齡36～81(中位60. 5)歲，結腸癌25例，直腸癌21例;高中分化29例，低分化17例;有淋巴結轉移16例，無淋巴結轉移30例;例; Duke分期A+B期30例，C+D 期16例;同時取距離腫瘤10 cm以上正常組織20例作對照。

1. 2主要試劑鼠抗人HSP90單克隆抗體(1∶100稀釋)，鼠抗人HIF-1α單克隆抗體(1∶100稀釋)，均購自Abcam公司，二抗購自Vector公司，三抗購自Sigma公司。

1. 3方法所有標本均由4%多聚甲醛固定，常規脫水，透明，石蠟包埋，4 μm連續石蠟切片，烤片，脫蠟，入水，破膜，pH6. 0檸檬酸液中微波熱修復中火5 min，停3 min，中火5 min; PBS清洗，加3%H2O2室溫下避光反應30 min; PBS清洗，加1∶2 000稀釋的酶k，于37℃溫箱反應20 min，; PBS清洗，加2%BSA于37℃溫箱反應30 min;甩液，加一抗，4℃孵育36 h，后室溫復溫2 h; PBS清洗，加二抗，37℃溫箱孵育1 h; PBS清洗，加SABC 液37℃孵育1 h; PBS清洗，DAB顯色8～10 min，蘇木素復染，脫水，透明，封片，其中以PBS代替一抗為陰性對照，用已知HSP90及HIF-1α陽性的大腸癌組織切片作陽性對照。

1. 4結果判定每例切片隨機抽取5個高倍鏡視野，腫瘤細胞陽性率分值為:＜10%，0分; 10%～25%，1分; 26%～50%，2 分; 51%～75%，3分;＞75%，4分;染色強度評分為:無色，0分;淡黃色，1分;棕黃色，2分;褐色，3分。兩者得分相乘，陰性≤2 分;陽性≥3分。

1. 5統計學方法采用SPSS12. 0軟件進行χ2檢驗和Spearman等級相關分析。

2　結果

2. 1 HSP90與HIF-1α蛋白在大腸癌及正常組織中的表達HSP90主要表達在腫瘤細胞的胞質和胞核，為棕黃色顆粒(圖1)，HSP90在正常組織，大腸腺癌中表達的陽性率分別為: 30. 0%，63. 0%，二者差異顯著(P＜0. 05); HIF-1α主要表達在腫瘤細胞的胞質和(或)胞核，為棕黃色顆粒(圖1)。HIF-1α在正常組織、大腸腺癌中表達的陽性率分別為: 15. 0%，71. 7%，二者差異顯著(P＜0. 05，表2)。

2. 2 HSP90與HIF-1α蛋白在大腸癌中表達及其與大腸癌臨床病理特征的關系HSP90表達與性別、年齡、部位無關(P＞0. 05);與分化程度、Duke分期及淋巴結轉移有關(P＜0. 05)。HIF-1α表達與性別、年齡、部位、分化程度無關(P＞0. 05);與Duke分期及淋巴結轉移有關(P＜0. 05)(表1)。

2. 3 HSP90與HIF-1α蛋白在大腸癌組織中表達的相關性HSP90與HIF-1α在大腸癌組織中表達的相關系數(r= 0. 420，P＜0. 01)，表明兩者呈正相關。

表1　 HSP90與HIF-1α在大腸癌中的陽性表達與大腸癌臨床病理特征的相關性〔n(%)〕

圖1　 HSP90、HIF-1α在大腸癌組織中的表達(SABC法，×400)

3　討論

腫瘤的發生發展及轉移侵襲是多基因，多因素，多階段共同作用的結果。HSPs又稱分子伴侶，其氨基酸序列高度保守，是細胞內蛋白質平衡的主要調控者，指導胞質，內質網，線粒體內蛋白質的折疊，轉運和細胞內定位，修復及降解變性蛋白，對錯誤折疊的蛋白質進行再折疊，防止蛋白質組錯配與集聚，并參與真核細胞內多種調控蛋白的最后激活，參與多種大分子蛋白復合體的重構，包括參與信號轉導，轉錄，細胞分裂，遷移及分化的蛋白質。在高溫，重金屬，缺氧及酸中毒等應激原存在的時候，其含量會增加〔6，7〕。

按分子量大小，HSPs可分為HSP110，90，70等〔8〕，HSP90即為分子量約90 kD的大分子蛋白質，主要由HSP90a，HSP90β組成，亦包含存在于內質網中的葡萄糖調節蛋白94(GRP94)及存在于線粒體中的TNF受體調控蛋白(TRAP1)〔9〕。生理狀態下，HSP90占細胞內總蛋白量的1%～2%，在應激狀態下，含量增長約2～10倍〔6，7，10〕。有研究表明在多種實體瘤(乳腺癌〔6〕，肝細胞性肝癌〔11〕，胃癌，鼻咽癌及卵巢癌〔12，13〕等)及血液學惡性腫瘤中表達均增加〔6〕。

HSP90的目的蛋白包括參與腫瘤細胞侵襲和轉移的基質金屬蛋白酶(MMP)2和尿激酶，維持血管再生的HIF、上皮生長因子受體(rEGFR)、類固醇受體輔助活化因子(SRC)等〔7，9〕，并通過調節蛋白激酶B(AKT)，腫瘤壞死因子受體(TNFR)，核因子κB的功能而抑制腫瘤細胞的凋亡。有研究示，結腸癌中HSP復合物表達水平與增殖細胞核抗原(PCNA)相關，認為HSP復合物可能與腫瘤細胞的快速增殖有關〔7，14〕。本研究表明在大腸癌組織中HSP90蛋白的表達明顯高于正常組織，提示可能在大腸癌形成初，因體內已存在缺氧，酸中毒等應激源，從而使大腸癌組織中HSP90的表達量明顯高于正常組織。

缺氧及遺傳變異可通過多種途徑使HIF-1α含量增加〔4，15～17〕。在多種腫瘤如結腸癌，乳腺癌，胃癌，肺癌，皮膚癌，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌和腎癌中均發現HIF-1α的高表達〔18〕。

HIF-1α作為轉錄激活因子，既參與13種不同的葡萄糖轉運蛋白、糖酵解酶、VEGF基因的編碼，又參與紅細胞生成素、轉鐵蛋白、內皮素-1、誘導型合成酶、血紅素氧化酶1、IGF-2、IGF結合蛋白2、3基因的編碼，而這些蛋白質多數與腫瘤的發生發展相關〔3，18〕。有研究表明由于在結腸腺瘤及前列腺上皮內瘤變等良性病變中亦發現HIF-1α呈高表達〔18〕，提示HIF-1α的增多可能通過使利于腫瘤發生發展的多種基因高表達，從而為大腸癌的發生提供了有利的環境。另外，HIF-1亦可調控編碼組織蛋白酶D，MMP2，尿激酶纖溶酶原激活物受體(uPAR)，纖連蛋白1，波形蛋白TGFα，自分泌移動因子，角蛋白14，18，19等已被確定在細胞侵襲的病理生理中起重要作用的蛋白的基因，且有研究表明即使是瞬間經歷缺氧，腫瘤細胞對離體基底膜的侵襲力亦增加〔3〕，而本研究表明HIF-1α亦可能通過對參與腫瘤轉移侵襲相關蛋白的基因調控，而對大腸癌的侵襲轉移過程起重要作用。

本研究分析表明在大腸癌的發生發展及侵襲轉移過程中兩者可能起協同作用，考慮聯合應用HSP90及HIF-1α的抑制劑可能會進一步提高大腸癌的治療效果。

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〔2014-08-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

通訊作者:熊枝繁(1962-)，男，碩士，主任醫師，教授，博士生導師，主要從事細胞因子與消化道腫瘤的關系研究。

基金項目:湖北省科技計劃自然科學基金課題(2011CDB368)

〔文章編號〕1005-9202(2015)20-5733-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 022

〔文獻標識碼〕A

〔中圖分類號〕R574. 6