PTD4-Apoptin融合蛋白可溶性表達及其對Hela細胞的抑制作用

荊鑫鑫　劉鴻飛　張　濤　張　強　葛堂棟　王明富　王躍新(佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江　佳木斯　154007)

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PTD4-Apoptin融合蛋白可溶性表達及其對Hela細胞的抑制作用

荊鑫鑫劉鴻飛張濤張強葛堂棟王明富王躍新(佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江佳木斯154007)

〔摘要〕目的構建PTD4-Apoptin融合蛋白的原核表達載體并表達蛋白，檢測其對Hela細胞的生長抑制作用。方法人工合成Apoptin序列和PTD4序列，構建pGEX-6p-1-PTD4-Apoptin原核表達載體，使其在E. coli BL21(DE3)中表達。使用GST親和層析柱純化融合蛋白，并使用超濾管濃縮純化后的目的蛋白，得到高濃度的融合蛋白。向Hela細胞中加入融合蛋白，檢測其對Hela細胞的生長抑制作用。結果PTD4-Apoptin融合蛋白在大腸桿菌中可溶性表達成功，對Hela細胞生長具有抑制作用，PTD4-Apoptin對Hela細胞抑制率達82. 34%。結論成功構建PTD4-Apoptin融合蛋白表達載體，并表達可溶性的融合蛋白，PTD4-Apoptin對Hela細胞具有明顯的抑制作用。

〔關鍵詞〕Apoptin; PTD4; Hela

凋亡素(Apoptin)是雞貧血病毒(CAV)編碼的對正常細胞無毒性作用的小分子蛋白質〔1，2〕，可選擇性地誘導腫瘤細胞的凋亡，而不傷害正常細胞，因此Apoptin是一種潛在的抗腫瘤藥物。天然Apoptin很難透過細胞膜進入細胞〔3〕，如果在Apoptin一級序列前連接上可介導生物大分子物質透過細胞膜進入細胞內的穿膜肽，即可穿過細胞膜進入細胞〔4〕。TAT穿膜肽與Apoptin連接表達的融合蛋白具有良好的抑瘤作用〔5〕，但人工合成的穿膜肽PTD4較TAT結構更穩定且穿膜效率更高〔6〕。目前有構建PTD4-Apoptin表達載體并表達，但得到的是PTD4-Apoptin融合蛋白的包涵體，還需要復性才具有活性〔7，8〕。本實驗旨在構建PTD4-Apoptin融合蛋白的可溶性表達載體并表達，獲得對腫瘤細胞具有高效穿膜作用的可溶性PTD4-Apoptin融合蛋白，研究其對Hela細胞的抑制作用。

1　材料和方法

1. 1載體和細胞質粒pGEX-6p-1購于深圳偉通生物科技有限公司，E. coli BL21(DE3)感受態菌購于天根生物科技有限公司，E. coli DH 5α、人宮頸癌Hela細胞由哈爾濱醫科大學惠贈。

1. 2試劑質粒提取試劑盒、DNA marker購于天根生物科技有限公司，SDS-PAGE凝膠試劑盒、蛋白質marker、4×SDS上樣緩沖液、離心超濾濃縮管、MTT試劑盒購于北京索萊寶生物科技有限公司，GST SefinoseTM Resin購于上海生工科技有限公司，限制性內切酶BamH I、EcoR I、Xho I、T4 DNA連接酶購于大連寶生物科技有限公司。

1. 3表達載體的構建

1. 3. 1 pGEX-6p-1-Apoptin載體構建優化Apoptin的編碼序列，使其在大腸桿菌中能更好表達。優化后的Apoptin編碼基因序列由上海生工生物工程有限公司合成，連接入質粒載體pGEX-6p-1的EcoR I和Xho I位點之間，得到重組載體pGEX-6p-1-Apoptin。

1. 3. 2 PTD4序列合成根據PTD4氨基酸序列YARAAARQARA，合成PTD4的DNA序列的2條互補的單核苷酸鏈，編碼鏈5＇端加上BamH I限制性酶切位點的黏性末端，反義鏈的5＇端加上EcoR I限制性酶切位點的黏性末端，由上海生工生物工程有限公司合成。正向序列: 5＇-GATCCTACGCCCGTGCCGCAGCCCGTCAGGCCCGTGCCG-3＇;反向序列: 5＇-AATTCGGCACGGGCCTGACGGGCTGCGGCACGGGCGTAG-3＇;將2條單核苷酸鏈等摩爾混合，加熱至95℃，降溫至25℃，形成雙鏈DNA分子。

1. 3. 3重組表達載體pGEX-6p-1-PTD4-Apoptin的構建限制性內切酶BamH I和EcoR I雙酶切重組質粒載體pGEX-6p-1-Apoptin，使用T4 DNA連接酶將PTD4的雙鏈DNA分子與重組質粒載體pGEX-6p-1-Apoptin酶切片段16℃連接過夜。連接產物轉化至E. coli DH 5α感受態菌株中，使用質粒提取試劑盒提取質粒，酶切驗證，將驗證正確的質粒送往上海生工生物工程有限公司，進行基因測序。

1. 3. 4表達載體pGEX-6p-1-PTD4-GFP的構建構建成功的表達載體pGEX-6p-1-PTD4-Apoptin由武漢淼靈生物科技有限公司改造為pGEX-6p-1-PTD4-GFP表達載體。

1. 4融合蛋白的表達重組載體pGEX-6p-1-PTD4-GFP和pGEX-6p-1-PTD4-Apoptin轉化至E. coli BL21(DE3)菌株。含目的質粒的菌株加入含氨芐青霉素的LB培養液中培養至OD600為0. 4～0. 6，加入IPTG至終濃度為0. 01 mmol/L，25℃誘導培養6 h，4℃存放過夜，同等條件下以pGEX-6p-1空載體為對照。離心收集菌體，冰預冷的PBS緩沖液重懸菌體，超聲破碎，離心收集上清和沉淀，進行SDS-PAGE電泳檢測。

1. 5融合蛋白的純化10倍柱體積冰預冷的PBS平衡GST親和層柱待用;收集破菌液上清，0. 22 μm濾膜過濾后上柱; 5倍柱體積的PBS洗柱4次;加入2 ml GST洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，多次洗脫后，收集洗脫液，使用4 ml的超濾柱濃縮，并更換蛋白緩沖液。

1. 6 PTD4-Apoptin融合蛋白對Hela細胞的抑制作用收集Hela細胞，分于96孔板，3 000個/孔。置于細胞培養箱中培養24 h后，加入PTD4-GFP和PTD4-Apoptin融合蛋白，繼續培養48 h后吸去上清，用PBS洗滌后，加入MTT工作液，繼續培養4 h，然后吸去上清，加入Formanzan溶解液，置于搖床上振蕩，待結晶紫充分溶解后，在490 nm波長下測量各孔的吸光值。以pGEX-6p-1空質粒載體的提取物作為對照。

1. 7統計學方法采用SAS9. 1. 3軟件進行單因素方差分析及t檢驗。

2　結果

2. 1表達載體的鑒定表達載體pGEX-6p-1-PTD4-GFP使用EcoR I和Xho I酶切驗證;表達載體pGEX-6p-1-PTD4-Apoptin，使用BamH I和Xho I酶切驗證，以pGEX-6p-1-Apoptin和pGEX-6p-1空質粒載體作為對照。pGEX-6p-1-PTD4-GFP雙酶切后在700 bp出現條帶，與預期結果一致，見圖1A。pGEX-6p-1-PTD4-Apoptin載體和pGEX-6p-1-Apoptin雙酶切后，在400 bp左右出現條帶，而且pGEX-6p-1-PTD4-Apoptin的酶切片段略大于pGEX-6p-1-Apoptin的酶切片段，與預期結果一致，見圖1B。基因測序結果顯示目的基因片段序列正確，見圖2。

圖2　 PTD4-Apoptin測序圖譜

2. 2融合蛋白的表達和純化載體表達提取液進行SDSPAGE電泳，以空質粒載體作為對照。電泳結果顯示，pGEX-6p-1-PTD4-GFP表達提取液上清和沉淀都在分子量43～70 kD之間有條帶，與預期融合蛋白的分子量計算值54 kD基本相符，而且在上清中融合蛋白大量表達。pGEX-6p-1-PTD4-Apoptin表達提取液上清和沉淀都在分子量31～43 kD之間有條帶，與預期融合蛋白的分子量計算值40 kD基本相符，而且融合蛋白在上清中的表達量明顯高于沉淀，說明pGEX-6p-1-PTD4-Apoptin主要表達可溶性的PTD4-Apoptin融合蛋白，見圖3～5。

圖3　 PTD4-GFP融合蛋白表達

圖4　 PTD4-Apoptin融合蛋白表達

目的蛋白經純化后SDS-PAGE電泳結果顯示，pGEX-6p-1-PTD4-GFP載體在分子量43～70 kD之間出現單一條帶，見圖6，表明PTD4-GFP融合蛋白純化成功。pGEX-6p-1-PTD4-Apoptin載體在分子量31～43 kD之間出現單一條帶，見圖7，表明PTD4-Apoptin融合蛋白純化成功。

圖5　 PTD4-GFP融合蛋白純化

圖6　鑒定PTD4-Apoptin融合蛋白

圖7　 PTD4-Apoptin融合蛋白對Hela細胞的抑制作用

2. 3 PTD4-Apoptin融合蛋白對宮頸癌細胞的抑制作用圖7可見，MTT結果顯示，PTD4-Apoptin融合蛋白與Hela細胞孵育后，對Hela細胞的抑制率達82. 34%，PTD4-Apoptin融合蛋白對Hela細胞具有明顯的抑制作用(P＜0. 001)，并且隨著PTD4-Apoptin融合蛋白濃度的升高，其對Hela細胞抑制作用也增強;而以PTD4-GFP和pGEX-6p-1提取物的對照組對Hela細胞并無明顯抑制作用(P＞0. 05)。

3　討論

為了解決天然Apoptin難以透過細胞膜進入細胞的特性，本研究利用基因工程的方法構建PTD4-Apoptin融合蛋白，利用穿膜肽的蛋白轉導活性使凋亡素進入細胞內。根據密碼子偏好性原則優化了PTD4和Apoptin的編碼序列，使其能在大腸桿菌中更容易表達，構建pGEX-6p-1-PTD4-Apoptin表達載體，可表達出結構更穩定的PTD4-Apoptin可溶性蛋白，且表達的PTD4-Apoptin融合蛋白具有顯著抑制Hela細胞生長的作用; 因PTD4-GFP融合蛋白對Hela細胞并無抑制作用，故PTD4-Apoptin融合蛋白抑制Hela細胞生長的作用是Apoptin的功效。本研究構建的pGEX-6p-1-PTD4-Apoptin表達載體，成功避開了因表達包涵體需要復性的過程，可直接得到表達大量活性PTD4-Apoptin融合蛋白，簡化了PTD4-Apoptin融合提取分離純化步驟，為進一步研究Apoptin的抗腫瘤作用機制奠定了基礎。由于pGEX-6p-1-PTD4-Apoptin表達的PTD4-Apoptin融合蛋白的前端含有谷胱甘肽S轉移酶(GST)標簽，該標簽對蛋白活性是否產生一定的影響尚需進一步研究。

4參考文獻

1 Zhou S，Zhang M，Zhang J，et al．Mechanisms of apoptin-induced cell death〔J〕．Med Oncol，2012; 29(4): 2985-91.

2武曉燕，候玲玲，晏瓊，等.凋亡素誘導細胞凋亡的機制及其在腫瘤治療中的應用〔J〕．生物學進展，2014; 45(1): 45-8.

3 Heilman DW，Teodoro JG，Green MR. Apoptin nucleocytoplasmic shuttling is required for cell type-specific localization，Apoptosis，and recruitment of the anaphase-promoting complex/cyclosome to PML bodies〔J〕．J Virol，2006; 80(15): 7535-45.

4劉德純，袁鵬飛，陳彥彬，等. TAT-Apoptin融合蛋白用于抗肝癌實驗研究〔J〕．中外醫療，2014; 15(1): 70-2.

5劉雪梅，崔劍，候劍偉，等. TAT-Apoptin融合蛋白分泌表達載體的構建及其活性檢測〔J〕．中國醫科大學學報，2013; 42(1): 45-8.

6李峰，陳嵐，肖新莉，等.蛋白質-外源物質進入細胞的新工具〔J〕．生命的化學，2004; 24(3): 192-5.

7 Sun J，Yan Y，Wang XT，et al．PTD4-apoptin therapy inhibits tumor growth in vivo〔J〕．Int J Cancer，2009; 124: 2973-81.

8 Jin JL，Gong J，Yin TJ，et al．PTD4-Apoptin protein and dacarbazine show synergistic antitumor effect on B16-F1 melanoma in vitro and in vivo〔J〕．Eur J Pharmacol，2011; 654(1): 17-25．

〔2014-09-19修回〕

(編輯李相軍)

通訊作者:張濤(1964-)，女，教授，碩士生導師，主要從事抗腫瘤藥物研究。

基金項目:黑龍江省自然基金項目(No. H201360);佳木斯大學研究生創新項目(No. LZR2014 _ 005);黑龍江省教育廳項目(No. 12531663);佳木斯大學重大項目(No. Szp2012-01)

〔文章編號〕1005-9202(2015)20-5737-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 024

〔文獻標識碼〕A

〔中圖分類號〕R73

第一作者:荊鑫鑫(1988-)，女，在讀碩士，主要從事抗腫瘤藥物研究。