陽離子-氯離子聯(lián)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑對(duì)氯胺酮麻醉模型小鼠的催醒影響及對(duì)其海馬凋亡的影響

唐俊霞　馮念海　陶　琦　(淄博市中心醫(yī)院麻醉科，山東　淄博　255036)

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陽離子-氯離子聯(lián)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑對(duì)氯胺酮麻醉模型小鼠的催醒影響及對(duì)其海馬凋亡的影響

唐俊霞馮念海陶琦(淄博市中心醫(yī)院麻醉科，山東淄博255036)

〔摘要〕目的探討陽離子-氯離子聯(lián)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(CCC)抑制劑對(duì)氯胺酮麻醉模型小鼠的催醒影響及對(duì)其海馬凋亡的影響。方法選取幼年SPF級(jí)昆明種小鼠60只，隨機(jī)分為兩組，其中對(duì)照組30只，實(shí)驗(yàn)組30只，予100 mg/kg氯胺酮腹腔注射，待小鼠翻正反射消失，反復(fù)腹腔注射100 mg/kg氯胺酮，維持麻醉時(shí)間為6 h后，予實(shí)驗(yàn)組小鼠布美他尼溶液100 μg/kg腹腔注射，同時(shí)予對(duì)照組等量的生理鹽水腹腔注射。對(duì)比兩組小鼠的蘇醒時(shí)間、海馬區(qū)細(xì)胞凋亡密度以及海馬區(qū)NMDA-2B受體表達(dá)情況。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組小鼠的蘇醒時(shí)間明顯短于對(duì)照組(P＜0. 05);高倍鏡下觀察顯示體積較正常細(xì)胞小者為凋亡細(xì)胞，其細(xì)胞核內(nèi)含紫藍(lán)色或黑色的凋亡小體，實(shí)驗(yàn)組凋亡細(xì)胞明顯少于對(duì)照組;實(shí)驗(yàn)組凋亡細(xì)胞密度與對(duì)照組比較明顯較低(P＜0. 05);免疫組化法檢測(cè)顯示NMDA-2B受體陽性細(xì)胞染色呈棕黃色，多位于CA3區(qū)海馬組織，分布均勻，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組的陽性細(xì)胞數(shù)目明顯較少; Western印跡法測(cè)定結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠的NMDA-2B受體灰度值明顯低于對(duì)照組(P＜0. 05)。結(jié)論CCC抑制劑對(duì)氯胺酮麻醉模型小鼠具有催醒作用，能夠明顯抑制其海馬細(xì)胞凋亡，對(duì)臨床具有指導(dǎo)意義，值得臨床推廣。

〔關(guān)鍵詞〕陽離子-氯離子聯(lián)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑;氯胺酮麻醉;催醒;海馬凋亡

氯胺酮廣泛應(yīng)用于小兒麻醉〔1〕。但有研究發(fā)現(xiàn)〔2〕，氯胺酮在麻醉過程中需要反復(fù)給藥，容易出現(xiàn)麻醉過深，蘇醒時(shí)間較長的現(xiàn)象，導(dǎo)致蘇醒延遲。另有研究顯示〔3〕，應(yīng)用氯胺酮能夠使幼鼠的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，影響幼鼠成年后的學(xué)習(xí)、認(rèn)知以及記憶能力。陽離子-氯離子聯(lián)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(CCC)抑制劑能夠控制離子通道，影響細(xì)胞內(nèi)外鈉離子、鉀離子、鈣離子、氯離子的轉(zhuǎn)運(yùn)及N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體的表達(dá)〔4，5〕，能夠減少氯胺酮的負(fù)面作用，縮短蘇醒時(shí)間，防止神經(jīng)細(xì)胞損傷。本文旨在探究CCC抑制劑對(duì)氯胺酮麻醉模型小鼠的催醒影響及對(duì)其海馬凋亡的影響。

1　對(duì)象與方法

1. 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組選取幼年(出生7 d)的SPF級(jí)昆明種小鼠60只(由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，雌性30只，雄性30只，體重(18±3)g。將大鼠隨機(jī)分為兩組，實(shí)驗(yàn)組30只，對(duì)照組30只。將小鼠置入安靜、溫暖、濕度適中、光照充足的環(huán)境中，以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，讓其自由進(jìn)食水。

1. 2主要試劑和儀器鹽酸氯胺酮注射液(北京紫竹藥業(yè)有限公司);布美他尼注射液(遼寧玉皇藥業(yè)有限公司);小鼠NMDA-2B抗體試劑盒(上海豐壽實(shí)業(yè)有限公司);磷酸鹽緩沖液(PBS)(BOSTER公司); Western封閉液、專用一抗二抗稀釋液、羊抗兔二抗(南京生興生物科技有限公司);蛋白電泳儀、離心機(jī)(美國貝克曼庫爾特公司); DW-86W100超低溫冰箱(青島海爾); SpectraMax M5酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices)。

1. 3造模方法正常適應(yīng)性飼養(yǎng)兩組小鼠3 d，全部小鼠予100 mg/kg氯胺酮腹腔注射，待小鼠連續(xù)仰臥3次且在5 s內(nèi)不能站立時(shí)即表示翻正反射消失〔5〕，反復(fù)腹腔注射100 mg/kg氯胺酮，維持麻醉時(shí)間為6 h; 6 h后給予實(shí)驗(yàn)組小鼠布美他尼溶液100 μg/kg腹腔注射，予對(duì)照組等量的生理鹽水腹腔注射。

1. 4觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1. 4. 1蘇醒時(shí)間小鼠翻正反射恢復(fù)即認(rèn)為其蘇醒，也就是連續(xù)仰臥3次之后可以恢復(fù)直立〔6〕，記錄兩組小鼠自翻正反射消失6 h后至翻正反射恢復(fù)的時(shí)間。

1. 4. 2小鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡情況檢測(cè)小鼠翻正反射恢復(fù)后，繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)24 h。將小鼠麻醉后處死，斷頭，取海馬組織，置于液氮中保存。取出部分海馬組織，利用4%多聚甲醛固定，采用梯度酒精脫水，常規(guī)石蠟包埋，切成4 μm切片備用。

將切片脫蠟→室溫下，置于0. 1%TritonX100液中→10 min后，流水沖洗→PBS沖洗3次，1 min/次→37℃下，加入標(biāo)記物→1 h后，PBS沖洗3次，1 min/次→37℃下，加入轉(zhuǎn)換液→30 min后，PBS沖洗3次，1 min/次→加入BCIP- NBT顯色→10 min后，流水沖洗→PBS沖洗3次，1 min/次→封片。

判定標(biāo)準(zhǔn)〔7〕:凋亡小體多位于細(xì)胞核內(nèi)，染色呈紫藍(lán)或黑，顏色越深凋亡細(xì)胞的密度越大。在高倍顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞數(shù)，采用醫(yī)學(xué)圖像管理系統(tǒng)計(jì)算凋亡細(xì)胞密度值。

1. 4. 3免疫組化法〔8〕檢測(cè)小鼠海馬組織NMDA-2B受體表達(dá)水平將備用切片脫蠟，利用梯度濃度酒精水化;利用3%過氧化氫水溶液使過氧化物酶變性;切片置入高溫檸檬酸溶液，進(jìn)行抗原修復(fù);冷卻后用PBS洗滌;室溫下，加5%胎牛血清(BSA)封閉;去除血清，加入稀釋后NMDA-2B抗體，37℃孵育1 h; PBS清洗5次，滴加二抗工作液，37℃孵育; 30 min后，PBS清洗5次;加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)液顯色5 min; PBS清洗5次后，采用蘇木素復(fù)染;清洗后常規(guī)脫水、透明、封片，利用高倍顯微鏡觀察，染色呈棕黃色者為陽性細(xì)胞。

1. 4. 4 Western印跡法測(cè)定小鼠海馬組織NMDA-2B受體表達(dá)水平取出保存于液氮中的海馬組織，剪碎，利用勻漿器研磨光滑; 12 000 r/min離心20 min;取上清，加入上樣緩沖液;高溫加熱5 min，樣本加入上樣孔中;電泳槽電壓80 V，進(jìn)行電泳;分離膠染色后，電壓改為120 V，電泳至染色區(qū)域距玻璃板1 cm;將凝膠染色轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上;室溫下，將PVDF膜置入含有Western印跡抗體的孵育盒中;封閉2 h后，用Tris鹽酸緩沖液(TBST)沖洗5 min，3次; PVDF膜置入稀釋的兔抗NMDA-2B溶液中，4℃搖床過夜;將PVDF膜置入稀釋后羊抗兔二抗溶液中2 h;清洗后，利用紅外激光成像系統(tǒng)掃描，觀察蛋白表達(dá)的灰度值〔7〕。

1. 5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS19. 0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2. 1兩組小鼠蘇醒時(shí)間比較實(shí)驗(yàn)組小鼠的蘇醒時(shí)間〔(3.17±2.36)min〕明顯短于對(duì)照組〔(6.35±2.74)min〕(P＜0.05)。

2. 2兩組小鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡情況比較高倍鏡下觀察顯示體積較正常細(xì)胞小者為凋亡細(xì)胞，其細(xì)胞核內(nèi)含紫藍(lán)色或黑色的凋亡小體，實(shí)驗(yàn)組凋亡細(xì)胞明顯少于對(duì)照組;實(shí)驗(yàn)組凋亡細(xì)胞密度(0. 98±0. 62)明顯低于對(duì)照組(3. 73±2. 11)(P＜0. 05)。見圖1。

2. 3免疫組化法檢測(cè)兩組小鼠海馬組織NMDA-2B受體表達(dá)比較NMDA-2B受體陽性細(xì)胞染色呈棕黃色，多位于CA3區(qū)海馬組織，分布均勻，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組的陽性細(xì)胞數(shù)目明顯較少，見圖2。

2. 4 Western印跡法測(cè)定兩組小鼠海馬組織NMDA-2B受體表達(dá)比較實(shí)驗(yàn)組小鼠的NMDA-2B受體灰度值(0. 81±0. 02)明顯低于對(duì)照組(1. 13±0. 04)(P＜0. 05)。見表1。

圖1　兩組小鼠海馬組織細(xì)胞凋亡情況(×400)

圖2　兩組NMDA-2B受體表達(dá)情況(×400)

表1　 Western印跡法測(cè)定小鼠海馬組織NMDA-2B受體蛋白比較(x±s)

3　討論

氯胺酮是一種NMDA受體拮抗劑，具有起效快、鎮(zhèn)痛效果好、對(duì)呼吸系統(tǒng)影響小等特點(diǎn)〔9〕，廣泛應(yīng)用于小兒麻醉。雖然氯胺酮安全性較高，但近年來有研究發(fā)現(xiàn)，由于麻醉作用表淺，需反復(fù)用藥，容易導(dǎo)致患者蘇醒的延遲〔10〕。另有研究認(rèn)為，小兒腦神經(jīng)尚未發(fā)育完全，生長過程中極易受到干擾〔11〕，氯胺酮對(duì)神經(jīng)功能的抑制作用亦能影響神經(jīng)細(xì)胞生長發(fā)育，而且，有實(shí)驗(yàn)研究表明，氯胺酮能夠誘導(dǎo)幼鼠神經(jīng)細(xì)胞的凋亡〔12〕，影響記憶、學(xué)習(xí)等功能。

本研究結(jié)果提示CCC抑制劑可以明顯抑制小鼠海馬組織細(xì)胞凋亡，防止神經(jīng)損傷;另外CCC抑制劑可能通過減少NMDA-2B受體的表達(dá)，來抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。資料顯示，CCC抑制劑可以影響細(xì)胞膜氯鈣通道的開放，促進(jìn)鈣離子內(nèi)流，增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度〔13〕，激活絲裂素活化蛋白激酶，消除氯胺酮對(duì)NMDA的拮抗作用〔14〕，減少細(xì)胞凋亡。本研究提示CCC抑制劑對(duì)氯胺酮麻醉小鼠具有催醒作用，可防止蘇醒延遲。

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〔2015-02-11修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2015)20-5740-02;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 025

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔中圖分類號(hào)〕R614

第一作者:唐俊霞(1968-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事老年麻醉研究。