貝那普利與丙泊酚聯(lián)合對糖尿病模型大鼠心肌缺血再灌注的影響

郝麗娜　侯少科　李建輝　曲振華　(邢臺市人民醫(yī)院麻醉科，河北　邢臺　054000)

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貝那普利與丙泊酚聯(lián)合對糖尿病模型大鼠心肌缺血再灌注的影響

郝麗娜侯少科李建輝曲振華(邢臺市人民醫(yī)院麻醉科，河北邢臺054000)

〔摘要〕目的研究貝那普利預(yù)處理后聯(lián)合丙泊酚對糖尿病模型大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響。方法選用成年大鼠60只，成功制備糖尿病模型后隨機(jī)分為模擬手術(shù)過程組，模型組，丙泊酚組，貝那普利組及貝那普利聯(lián)合丙泊酚組。再灌注完成后即刻測檢各項(xiàng)心肌酶(乳酸脫氫酶、肌酸激酶和肌酸激酶同工酶)、心肌組織中SOD活性、丙二醛含量;測定Caspase-3表達(dá);應(yīng)用Western印跡法測定Akt的磷酸化(p-Akt)水平。結(jié)果丙泊酚單獨(dú)應(yīng)用對3項(xiàng)觀察指標(biāo)都有顯著影響，有較好的心肌保護(hù)作用;貝那普利單獨(dú)應(yīng)用有輕微的心肌保護(hù)作用(只影響心肌酶);貝那普利聯(lián)合丙泊酚用藥后作用較丙泊酚單獨(dú)應(yīng)用對大鼠心肌缺血再灌注的保護(hù)作用進(jìn)一步增強(qiáng)。結(jié)論貝納普利單獨(dú)應(yīng)用對心肌的保護(hù)作用有限，但與丙泊酚聯(lián)合用藥能顯著增強(qiáng)對糖尿病大鼠心肌缺血再灌注的保護(hù)作用。

〔關(guān)鍵詞〕丙泊酚;貝那普利;糖尿病;缺血再灌注

氧化應(yīng)激反應(yīng)與糖尿病并發(fā)癥的產(chǎn)生及進(jìn)展有著很密切的關(guān)系，針對氧化反應(yīng)的抗氧化治療可減輕心肌細(xì)胞及心肌組織的損傷。丙泊酚是一種鎮(zhèn)靜劑，有抗氧化作用，可有效減輕心肌缺血再灌注損傷，產(chǎn)生確切的心肌保護(hù)作用〔1～3〕。有研究表明，與單純一種預(yù)處理方法比較，不同預(yù)處理方法聯(lián)合應(yīng)用時(shí)減輕心肌缺血再灌注的效應(yīng)增強(qiáng);但也有不同的結(jié)論〔4～6〕。本研究觀察貝那普利、丙泊酚以及二者聯(lián)合處理對糖尿病模型大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

1　材料與方法

1. 1動物選擇及制備糖尿病模型選用河北省實(shí)驗(yàn)動物中心提供的成年健康SD大鼠，雌雄不限，體重260～320 g。遵守《實(shí)驗(yàn)動物福利和應(yīng)用指南》。參照文獻(xiàn)〔7〕制備大鼠2型糖尿病模型。高脂高糖喂養(yǎng)5 w后，腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司，美國，溶解于檸檬酸緩沖液中)30 mg/kg，1次/d，連續(xù)2 d; 72 h后尾靜脈采血測定空腹血糖，以血糖≥16. 7 mmol/L，并出現(xiàn)明顯多尿和多飲為2型糖尿病模型制備成功。

1. 2分組及制備缺血再灌注模型麻醉大鼠，然后氣管插管進(jìn)行機(jī)械通氣。股動、靜脈置管分別連接于麻醉監(jiān)測儀和微量輸液泵用于監(jiān)測血壓和給藥，連接Ⅲ導(dǎo)聯(lián)心電監(jiān)測。待血壓和心率穩(wěn)定后，開胸，暴露心臟，在冠脈左前降支(LAD)下方穿線，結(jié)扎線下墊硬管，以便松開結(jié)扎線恢復(fù)血流。缺血30 min，再灌注2 h制備大鼠心肌缺血再灌注損傷模型。模型是否成功的檢查方法:結(jié)扎部位遠(yuǎn)端心肌顏色變成暗紅色，在心電圖上可見S-T段顯著抬高以及T波高聳。

取糖尿病模型制備成功的大鼠60只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為5組(n=12):模擬手術(shù)過程組:開胸，分離冠脈左前降支，只穿線，不結(jié)扎，不阻斷血流，不造成心肌缺血。模型組:阻斷LAD 30 min后給予生理鹽水再灌注2 h，制造缺血再灌注模型;丙泊酚組:從缺血之前10 min開始持續(xù)靜脈滴注丙泊酚8 mg·kg－1·h－1，其余操作同模型組;貝那普利組:術(shù)前12 h灌胃貝那普利6 mg/kg(以0. 5%羧甲基纖維素鈉配制)，其余操作同模型組。丙泊酚、貝那普利聯(lián)合用藥組:術(shù)前12 h灌胃貝那普利6 mg/kg(以0. 5%羧甲基纖維素鈉配制)，其余操作同丙泊酚組。

1. 3心肌酶檢測再灌注操作完成后立即采集頸動脈血液，在4℃條件下以3 000 r/min速度離心10 min，抽上清液，嚴(yán)格按照試劑說明書，在生化分析儀上測定乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)。

1. 4心肌組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量再灌注操作完成后摘取心臟，剪取梗死區(qū)域及部分邊緣組織，洗凈血液之后制成勻漿，此過程中均用冰生理鹽水。取上清液步驟同上，檢測勻漿SOD活性以及MDA含量。按試劑盒說明書操作。

1. 5免疫組化方法測定Caspase-3表達(dá)自結(jié)扎點(diǎn)遠(yuǎn)端，左心室等厚切為甲、乙2份(均包括正常區(qū)和危險(xiǎn)區(qū))。取甲份心肌組織按下列步驟處理:用10%甲醛固定，石蠟包埋，切片之后脫蠟處理，加入1∶100兔抗大鼠Caspase-3多克隆抗體4℃過夜。再加入生物素化二抗，加入過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水，采用二甲苯中性透明樹膠封片。顯微鏡觀察顯示若為棕黃色顆粒即是Caspase-3蛋白陽性反應(yīng)，于光學(xué)顯微鏡下400倍放大，隨機(jī)選擇無重疊的5個(gè)視野，用Image-ProPlus圖像分析軟件分析Caspase-3吸光度。

1. 6 Western印跡法測定Akt的磷酸化(p-Akt)水平取乙份心肌組織提取總蛋白，定量分裝，－70℃保存，取蛋白提取液上清液，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，封閉洗脫，分別加入1∶1 000兔抗大鼠Akt和P-Akt(Ser473)多克隆抗體，4℃過夜，洗膜，二抗孵育，以β-肌動蛋白為對照調(diào)整上樣量，用ECL法顯示，暗室X光膠片曝光，用Image-ProPlus圖像分析軟件進(jìn)行分析。蛋白含量以目的蛋白與β-肌動蛋白條帶吸光度比值計(jì)算，Akt的磷酸化水平以P-Akt蛋白占Akt總蛋白的百分?jǐn)?shù)來表示。

1. 7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17. 0軟件，兩組之間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn);采用Pearson法進(jìn)行兩變量間的相關(guān)分析。

2　結(jié)果

2. 1對各項(xiàng)心肌酶活性的影響模型組血清中各項(xiàng)心肌酶活性較模擬手術(shù)過程組升高(P＜0. 05);與模型組比較，貝那普利組、丙泊酚組以及聯(lián)合用藥組可明顯降低各項(xiàng)心肌酶活性(P＜0. 05);貝那普利組較丙泊酚組高(P＜0. 05)，聯(lián)合用藥組較丙泊酚組低(P＜0. 05)，見表1。

2. 2對心肌組織SOD活性和MUA含量的影響模型組心肌組織SOD活性較模擬手術(shù)過程組降低MDA含量升高(P＜0. 05);貝那普利組有使SOD活性增高及MDA含量降低的趨勢，但與模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0. 05)。丙泊酚組及聯(lián)合用藥組與模型組比較，可明顯升高SOD活性、降低MDA含量(P＜0. 05);聯(lián)合用藥組較丙泊酚組改變更多(P＜0. 05)，見表2。

2. 3對Caspase-3表達(dá)及P-Akt水平的影響模擬手術(shù)組冠脈LAD支配區(qū)心肌細(xì)胞組織中無或僅有個(gè)別心肌細(xì)胞Caspase-3呈弱陽性表達(dá)(0. 21±0. 04);模型組LAD支配區(qū)缺血半暗帶心肌細(xì)胞組織中Caspase-3呈強(qiáng)陽性片狀表達(dá)，黃色顆粒即為其陽性反應(yīng)產(chǎn)物，主要在胞質(zhì)中表達(dá)(6. 14±0. 52，P＜0. 05);丙泊酚組(1. 89±0. 31)和聯(lián)合用藥組心肌中Caspase-3的表達(dá)與模型組相比明顯減少和(1. 52±0. 23，均P＜0. 05)，且聯(lián)合用藥組小于丙泊酚組(P＜0. 05);而貝那普利組與模型組比較Caspase-3的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(5. 98±0. 46，P＞0. 05)。

表1　各組CK、CK-MB、LDH水平比較(n=12，x±s)

表2　各組心肌組織SOD活性及MDA含量的比較(n=12，x±s)

五組的Akt總表達(dá)量之間無明顯差異(P＞0. 05)。與模擬手術(shù)過程組(23. 2±3. 5)比較，模型組(11. 8±2. 1)和貝那普利組(14. 6±2. 4)的p-Akt(62. 4±3. 7)水平降低(均P＜0. 05)，丙泊酚組(62. 4±3. 7)和聯(lián)合用藥組(58. 2±4. 3)P-Akt水平升高(P＜0. 05);與模型組比較，丙泊酚組和聯(lián)合用藥組P-Akt水平明顯升高(均P＜0. 05);而貝那普利組與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0. 05)。

3　討論

糖尿病患者的心肌組織存在著不同于一般患者的病理生理改變，如內(nèi)分泌代謝紊亂、心肌肥大、鈣平衡調(diào)節(jié)異常等，這些異常改變很可能使糖尿病心肌對缺血再灌注損傷的反應(yīng)性與一般患者的不同，對一般患者具有保護(hù)作用的藥物或治療用在糖尿病患者身上，可能會發(fā)生作用減弱或消失。以往研究已經(jīng)證實(shí)丙泊酚能夠減輕心肌的缺血再灌注損傷，但是丙泊酚對糖尿病心肌缺血再灌注損傷是否同樣具有保護(hù)作用?血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑可減少血管緊張素Ⅱ的形成，抑制緩激肽的降解，擴(kuò)張冠狀動脈，改善微循環(huán)，改善心肌能量代謝。廣泛用于治療高血壓、心功能不全。貝那普利是臨床常用的一類血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑。心肌缺血再灌注損傷的確切機(jī)制尚未完全清楚，通常認(rèn)為是多方面、多個(gè)機(jī)制聯(lián)合作用的結(jié)果〔8，9〕。采用多種不同保護(hù)機(jī)制的藥物聯(lián)合使用，是否能夠增強(qiáng)對心肌的保護(hù)作用?

血清心肌酶學(xué)的升高幅度與心臟損傷的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，丙泊酚和貝那普利單獨(dú)應(yīng)用時(shí)均可降低各項(xiàng)心肌酶活性，丙泊酚的心肌保護(hù)作用較貝那普利強(qiáng)，聯(lián)合用藥后作用增強(qiáng)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，丙泊酚聯(lián)合貝那普利可有效減輕缺血再灌注對糖尿病大鼠心肌造成的損傷。在心肌缺血再灌注模型中血管緊張素Ⅱ增多，而血管緊張素Ⅱ增多是導(dǎo)致心肌缺血再灌注損傷的原因之一〔10〕。血管緊張素Ⅱ一方面作用在AT1受體，可引起血管收縮，導(dǎo)致心肌耗氧量增加，直接對心肌細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用;另外一方面還可引起醛固酮分泌增多，導(dǎo)致水鈉潴留，循環(huán)血量增加，從而導(dǎo)致心血管負(fù)荷加重，減少緩激肽的降解，對心肌造成傷害。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑能抑制血管緊張素Ⅱ生成，從而減輕缺血再灌注損傷。

糖尿病模型大鼠心肌組織中本來存在自由基生成過多、抗氧化酶活性降低，自由基不能及時(shí)有效清除，使脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)等問題。如果在此基礎(chǔ)上加上心肌缺血再灌注，那么自由基將進(jìn)一步增多，導(dǎo)致組織的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)進(jìn)一步增強(qiáng)，促進(jìn)膜蛋白和磷脂交聯(lián)，引起相應(yīng)蛋白質(zhì)的不可逆變性，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能損傷。SOD是內(nèi)源性自由基清除系統(tǒng)的主要成員，其活性降低必然導(dǎo)致氧自由基的積聚，從而使細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，引起代謝產(chǎn)物MDA的含量增多，MDA的增多對心肌細(xì)胞膜有很強(qiáng)的破壞作用。因此，丙二醛含量和SOD活性可反映機(jī)體清除氧自由基的能力，從而間接反映氧化應(yīng)激反應(yīng)程度〔11，12〕。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示心肌在缺血再灌注之后會產(chǎn)生大量的氧自由基，介導(dǎo)了過氧化反應(yīng)。丙泊酚可能是對氧化應(yīng)激中的多個(gè)環(huán)節(jié)產(chǎn)生影響〔13，14〕，其化學(xué)結(jié)構(gòu)類似于內(nèi)源性抗氧化劑維生素E，可直接與自由基結(jié)合，使自由基失去活性，從而減少自由基對心肌細(xì)胞的損傷。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)丙泊酚單獨(dú)應(yīng)用可提高SOD活性，降低MDA含量。貝那普利雖然單獨(dú)應(yīng)用與模型組無顯著性差異，但聯(lián)合丙泊酚應(yīng)用作用較丙泊酚進(jìn)一步增強(qiáng)。

細(xì)胞凋亡與糖尿病心血管并發(fā)癥及心肌缺血再灌注損傷密切相關(guān)，糖尿病所致心肌病變的發(fā)生發(fā)展過程中存在著心肌細(xì)胞凋亡〔15〕。糖尿病心肌本來已經(jīng)存在著氧化應(yīng)激，在此基礎(chǔ)上的缺血再灌注必然使活性氧的生成進(jìn)一步增加，這也是引起心肌缺血再灌注損傷的重要原因。細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶之一就是Caspase-3，Caspase-3是白介素轉(zhuǎn)換酶家族成員，是凋亡過程末段關(guān)鍵蛋白酶，也是凋亡程序的效應(yīng)分子。雖然在心肌缺血再灌注過程中的細(xì)胞凋亡機(jī)制尚未完全清楚，但Caspase-3的活化是目前公認(rèn)的凋亡的最后通路，它的活化可以使核酸內(nèi)切酶激活，使DNA修復(fù)酶失活以及細(xì)胞骨架蛋白降解，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔16～18〕。Akt是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶中的一種，通常為PI3K下游的目標(biāo)蛋白，Akt磷酸化是Akt激活的必要條件，當(dāng)細(xì)胞膜表面受到前程信號刺激時(shí)，引起Akt磷酸化，從而使其激活，活化Akt又可引起糖原合酶激酶-3、Caspase-3等下游底物磷酸化，經(jīng)過這樣一系列復(fù)雜過程最后起到促細(xì)胞生存和抗凋亡的作用。Akt的活化程度通常采用PAkt蛋白與總Akt蛋白含量的比值來表示〔19～21〕。本研究結(jié)果提示Akt以及Caspase-3蛋白參與了心肌組織缺血再灌注時(shí)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Caspase-3表達(dá)與心肌細(xì)胞凋亡之間呈正相關(guān)，丙泊酚可抑制Caspase-3的表達(dá)，增加Akt的磷酸化水平，提示丙泊酚可以促進(jìn)Akt活化來抑制其下游底物Caspase-3的表達(dá)。貝那普利雖然單獨(dú)應(yīng)用與模型組無顯著差異，但聯(lián)合丙泊酚用藥后作用較丙泊酚單獨(dú)應(yīng)用對大鼠心肌缺血再灌注的保護(hù)作用進(jìn)一步增強(qiáng)。

綜上所述，丙泊酚對糖尿病心肌在缺血再灌注時(shí)有較好的保護(hù)作用;貝那普利單獨(dú)應(yīng)用只影響心肌酶，對心肌保護(hù)作用有限;貝那普利與丙泊酚聯(lián)合用藥能顯著增強(qiáng)其作用，推測其機(jī)制可能與抑制血管緊張素Ⅱ的生成有關(guān)，其確切作用機(jī)制有待于進(jìn)一步探討。

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〔2015-02-26修回〕

(編輯李相軍)

基金項(xiàng)目:邢臺市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(No．2014ZC168)

〔文章編號〕1005-9202(2015)20-5744-04;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 027

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔中圖分類號〕R614. 2

第一作者:郝麗娜(1981-)，女，主治醫(yī)師，主要從事心血管麻醉、臨床麻醉研究。