小鼠大腦缺氧后eIF4G在腦組織中的表達(dá)

高艷斌　張林慶　馬　可李家宏　任　強(qiáng)陳志明(長春市公安局刑警支隊(duì)，吉林　長春　30000)

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小鼠大腦缺氧后eIF4G在腦組織中的表達(dá)

高艷斌張林慶馬可1李家宏任強(qiáng)2陳志明2(長春市公安局刑警支隊(duì)，吉林長春130000)

〔摘要〕目的探討小鼠顱腦缺氧后eIF4G隨時(shí)間變化基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)改變。方法將50只大鼠隨機(jī)分為10組，采用手術(shù)結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈，分別于術(shù)后2、8、24 h、1、3、6、9、12及16 d處死，應(yīng)用RT-PCR檢測eIF4G的表達(dá)變化。結(jié)果eIF4G在腦缺氧2 h后表達(dá)增高，且隨時(shí)間延長表達(dá)持續(xù)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論eIF4G在小鼠腦缺氧后增高，說明蛋白翻譯過程在腦缺氧后發(fā)揮重要作用。

〔關(guān)鍵詞〕腦缺氧; eIF4G

1吉林大學(xué)第一醫(yī)院兒科急診2吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)教研室

第一作者:高艷斌(1976-)，男，副主任法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)學(xué)研究。

翻譯是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成過程中的關(guān)鍵步驟，在細(xì)胞增殖、分化、程序性死亡及適應(yīng)環(huán)境方面均分揮著重要作用〔1〕。對于翻譯調(diào)節(jié)因子的表達(dá)調(diào)控可顯著延緩衰老，而其中尤以對翻譯起始因子4G(eIF4G)的調(diào)節(jié)所表現(xiàn)的生物學(xué)行為改變最為顯著〔2〕。對eIF4G的調(diào)控為細(xì)胞啟動(dòng)蛋白合成的重要限速步驟，其在腦缺氧后的表達(dá)變化卻鮮有報(bào)道。本研究對eIF4G表達(dá)與小鼠腦缺氧后不同時(shí)間段的關(guān)系進(jìn)行研究。

1　材料與方法

1. 1動(dòng)物分組及模型建立雄性昆明系小鼠50只，隨機(jī)分為正常對照及腦缺氧組。腦缺氧組分別于術(shù)后2、8、24 h、1、3、6、9、12及16 d處死，共10組。處死后腦組織迅速置于液氮中，5 min后取出保存于－80℃冰箱中。采用手術(shù)結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈，用10%水合氯醛(0. 35 g/kg體重)腹腔內(nèi)注射麻醉，剪去頸部皮毛，消毒皮膚后，沿中線切開皮膚，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈后，結(jié)扎后縫合皮膚，置鼠籠喂養(yǎng)。正常對照組僅切開頸部皮膚，但并不結(jié)扎動(dòng)脈。

1. 2方法

1. 2. 1 RNA提取稱取100 mg腦組織用1 ml Trizol進(jìn)行裂解;將Trizol裂解液轉(zhuǎn)入EP管中，15℃～30℃放置5 min;加0. 2 ml氯仿后用力震蕩15 s，室溫下放置2～3 min，12 000 r/min(2℃～8℃)離心15 min。取上層水相置于新EP管中，加0. 5 ml異丙醇，15℃～30℃放置10 min，12 000 r/min(2℃～8℃)離心10 min。加1 ml 75%乙醇進(jìn)行洗滌，渦旋混合，7 500 g(2℃～8℃)離心5 min，棄上清;讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥; 用RNAse-free水溶解RNA沉淀。采用RT-PCR試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR。

1. 2. 2 Real-time PCR檢測取0. 2 ml薄壁PCR管，分別編號。向各管中加入2×qPCR TaqMix 12. 5 μl，10 μmol/L各基因正反向引物混合物0. 5 μl。管中不加模板用作陰性對照。各管補(bǔ)加水至25 μl。混勻置于熒光定量PCR儀中。本研究所用引物序列見表1。

1. 3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS3. 0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，應(yīng)用單因素方差分析和各組均數(shù)t檢驗(yàn)處理。

2　結(jié)果

eIF4G在顱腦缺氧后表達(dá)持續(xù)增高，在正常頸動(dòng)脈未結(jié)扎腦組織中，eIF4G表達(dá)量較穩(wěn)定;在顱腦缺氧2 h后表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且隨缺氧時(shí)間延長后持續(xù)增高，缺氧24 h后達(dá)峰值。見表2。

表1　 Real-time PCR所用引物序列

表2　 eIF4G在小鼠大腦缺氧后腦組織轉(zhuǎn)錄表達(dá)變化(x±s)

3　討論

蛋白翻譯調(diào)節(jié)對于細(xì)胞生長及適應(yīng)環(huán)境方面均具有重要意義〔3〕。翻譯過程包括三個(gè)步驟，翻譯起始、翻譯延伸及翻譯終止。盡管對?翻譯各個(gè)階段的調(diào)節(jié)均對細(xì)胞生物學(xué)行為具有重要影響，但對翻譯起始的調(diào)節(jié)卻是對翻譯過程調(diào)節(jié)的重要限速步驟〔4〕。翻譯起始過程既包括蛋白與RNA的相互作用，也包括蛋白與蛋白的相互作用，許多翻譯起始因子參與上述過程，但eIF4G為此過程中最重要的調(diào)節(jié)蛋白，其可作為核糖體蛋白及mRNA的重要橋接蛋白〔5〕。盡管eIF4G為翻譯過程中最重要的調(diào)節(jié)蛋白，其表達(dá)缺陷可導(dǎo)致細(xì)胞死亡，適當(dāng)減少eIF4G的表達(dá)可延緩衰老，并延長生命。另外，其對于細(xì)胞適應(yīng)應(yīng)激過程亦發(fā)揮著重要作用，從而在細(xì)胞缺氧耐受及腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用〔6，7〕。

腦組織的長期慢性缺氧與老年患者神經(jīng)退行性變的發(fā)生密切相關(guān)，而翻譯過程的調(diào)節(jié)異常與其發(fā)生發(fā)展的關(guān)系卻鮮有報(bào)道。在本研究中，本文顱腦缺氧后，翻譯過程異常不僅出現(xiàn)在急性期，在腦組織缺氧后長期持續(xù)存在，提示對翻譯異常的糾正可為臨床治療及預(yù)防腦神經(jīng)退行性變提供新的理論基礎(chǔ)。

4參考文獻(xiàn)

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〔2014-03-17修回〕

(編輯袁左鳴)

通訊作者:陳志明(1977-)，男，講師，主要從事法醫(yī)病理學(xué)研究。

〔文章編號〕1005-9202(2015)20-5750-02;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 029

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔中圖分類號〕R74