不同濃度的糜酶對自發性高血壓大鼠心肌肥厚細胞的構建

宋　晶　郭家娟　李相軍崔英子　魏　巖　(長春中醫藥大學附屬醫院，吉林　長春　3002)

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不同濃度的糜酶對自發性高血壓大鼠心肌肥厚細胞的構建

宋晶郭家娟李相軍1崔英子魏巖(長春中醫藥大學附屬醫院，吉林長春130021)

〔摘要〕目的探討糜酶對自發性高血壓大鼠(SHR)心室肥厚模型的最佳誘導時間及濃度。方法將肥厚心肌細胞分為對照組(加無血清DMEM培養液)和實驗組。實驗組分別給予糜酶(chymase)7. 5、15、30和60 μg/L 4個濃度組，分別培養24、48 h，誘導小鼠心肌細胞肥大，測定培養液中AngⅡ濃度、β-actin和ANP基因表達以評價模型是否成功。結果實驗組中糜酶濃度為30 μg/L，培養48 h后培養液中AngⅡ濃度明顯高于對照組(P＜0. 05);并且糜酶濃度為30 μg/L，培養48 h后培養液中細胞β-actin和ANP基因表達高于對照組(P＜0. 05)。結論糜酶濃度在30 μg/L、培養48 h為誘導SHR心肌肥厚的最佳濃度及時間。

〔關鍵詞〕糜酶;自發性高血壓大鼠;心肌肥厚

1吉林大學藥學院

第一作者:宋晶(1987-)，女，在讀碩士，主要從事心血管疾病研究。

左心室肥厚是原發性高血壓(EH)導致靶器官損傷中最嚴重的類型，會引發惡性心律失常、心肌梗死、心衰等連鎖反應。研究表明，抑制左心室肥厚會抑制這種連鎖反應的發生，從而減少心血管事件的發病率和死亡率〔1〕。腎素-血管緊張素系統(RAS)在調節容量超負荷或壓力超負荷導致的心肌肥厚中起重要作用〔2〕;心肌細胞肌蛋白合成，導致心肌細胞肥大，從而發生心肌肥厚。血管緊張素(Ang)Ⅱ是目前最強的促心肌細胞肌蛋白合成因子〔3〕。而在心臟組織中，糜酶(Chymase)是AngⅡ形成的主要酶類之一，β-actin和ANP基因表達為心肌肥厚的重要標志。檢測AngⅡ及相關信號分子基因、蛋白的表達，多層次、多角度系統研究糜酶AngⅡ途徑干預心室肥厚機制，可以進一步豐富以心室肥厚為重要病理環節的心血管治療研究思路。

1　材料與方法

1. 1材料純化肥大細胞糜酶(Merck公司); AngⅡ放射免疫

分析試劑盒(上海偉寰生物科技有限公司);心肌細胞株H9c2(上海艾研生物科技有限公司);血清DMEM培養液(上海杰美基因醫藥科技有限公司)

1. 2方法將大鼠心肌細胞分為對照組(加無血清DMEM培養液)和不同劑量糜酶刺激組，后者將糜酶加入到無血清DMEM培養液中致糜酶終濃度為7. 5、15、30和60 μg/L，分別培養24 h和48 h后檢測各組培養上清AngⅡ含量及細胞β-actin和ANP基因表達。

1. 2. 1 AngⅡ濃度測定用AngⅡ放射免疫分析試劑盒測定。將細胞(105個/孔)接種于24孔板，培養48 h，每孔吸取800 μl培養液，加入裝有20 μl預冷的糜酶培養液(濃度分別為7. 5、15、30和60 μg/L)的管中，離心5 min(4℃，300 r/min)，取上清液，采用AngⅡ放射免疫分析試劑盒測定。

1. 2. 2采用逆轉錄Real-time PCR法檢測各組細胞β-actin、ANP基因

1. 2. 2. 1 PCR反應引物ANP基因:正向序列5＇-gga gcc tgc gaa ggt caa-3＇，反向序列5＇-tat ctt cgg tac cgg aag ctg t-3＇;β-actin:正向序列5＇-ccc gcg agt aca acc ttc t-3＇，反向序列5＇-cgt cat cca tgg cga act-3＇。

1. 2. 2. 2提取心肌細胞總RNA使用0. 25%胰蛋白酶-EDTA對心肌細胞進行消化后，Hank液重懸細胞并轉至10 ml離心管中;懸浮培養細胞則直接轉到離心管中; 2 000 r/min離心10 min;加入Hank液，再離心、洗滌各兩次，去除上清液，冰浴(之后各項操作均在冰浴中進行)。收獲細胞(5×106/L)，并將其移入到1. 5 ml Ep管內。加入1 ml TRIzol試劑，混合均勻，放置于室溫中5 min;加入0. 2 ml氯仿，振搖時間為15 s，室溫下放置3 min; 4℃、10 000 r/min離心5 min，吸取上層水相轉移至新Ep管中，加入0. 5 ml的異丙醇，放置于室溫中10 min; 4℃條件下進行低溫離心，10 000 r/min離心10 min，加入75%的1 ml乙醇，進行搖振，再對其充分洗滌和沉淀，4℃、5 000 r/min離心5 min，棄上清液，真空干燥處理，沉淀重懸于100 μl的無RNase水中。保存于－70℃條件下備用;并用紫外分光光度計檢測RNA濃度和純度。

1. 2. 2. 3 PCR擴增依照PCR反應試劑盒說明書步驟操作，將上游引物和下游引物各1 μl，Superscript/Tag混合物1 μl，待測RNA 1 μg，純水50 μl混合均勻，再加入30 μl石蠟。反應條件: 55℃15 min，94℃12 min，1個循環; 94℃15 s，55℃30 s，72℃1 min，35個循環; 72℃10 min，1個循環。

1. 2. 2. 4 PCR產物電泳制取1. 5%瓊脂糖凝膠(含溴乙錠0. 3 mg/ml)，取PCR產物10 μl進行電泳，電泳后將凝膠取出，將其放置于紫外分析儀內進行觀察并對其進行定量分析，用待測基因/GAPDH比值代表待測ANP基因和β-actin mRNA的相對水平。

1. 3統計學方法采用SPSS18. 0軟件行單因素方差分析、t檢驗。

2　結果

糜酶濃度為30 μg/L，培養時間24 h、48 h時，AngⅡ濃度與對照組比較均有顯著差異(P＜0. 05)，同濃度糜酶培養48 h與培養24 h AngⅡ濃度比較有統計學意義(P＜0. 05);糜酶濃度為30 μg/L，培養時間24 h、48 h時，細胞中β-actin、ANP的含量與對照組比較均有顯著差異(P＜0. 05);相同濃度糜酶培養48 h與培養24 h，細胞中ANP含量比較有統計學意義(P＜0. 05)。見表1。

表1　測得培養液中AngⅡ、β-actin、ANP的濃度(x±s)

3　討論

RAS系統在調節前后負荷導致的心肌肥厚中起重要作用〔2〕，其中AngⅡ占主導地位。近年來研究證實，人類心肌局部AngⅡ主要來源于血管緊張素轉換酶(ACE)和糜酶兩條途徑，在人體心臟80%的AngⅡ通過糜酶產生。多項研究證實，糜酶在心室肥厚、心肌纖維化及心衰的發生、發展中起重要作用〔4〕。大量研究表明，β-actin作為Wnt/β-actin信號通路的關鍵成員在介導信號轉導過程中調控細胞的增殖和凋亡〔5〕。ANP基因表達為心肌肥厚的重要標志，在正常心肌組織中表達量很低，如果檢測到其表達量明顯增加，為病理性心肌肥大的可靠指標。本研究同時以β-actin和ANP基因兩種指標作為研究對象，使研究結果更加嚴謹可靠。而實驗結果說明不同濃度的糜酶刺激心肌細胞，使細胞內AngⅡ濃度增高，細胞中肥大基因(β-actin、ANP)表達，導致心肌細胞肥大。而細胞內AngⅡ濃度、β-actin與ANP的基因表達與糜酶濃度以及培養時間密切相關。通過測定實驗指標，糜酶濃度在30 μg/L、培養48 h時，為最佳誘導濃度及時間。

左心室肥厚為高血壓患者中最常見的并發癥之一，嚴重影響人類的生活質量，將血壓維持在正常水平，可有效減少并發癥;去除引起并發癥的誘因，可減少并發癥的發生，同時亦可通過此法，將血壓維持在正常水平。本實驗為臨床上治療高血壓、減少高血壓引起的心肌肥厚提供了良好的理論依據。

4參考文獻

1 Okin PM，Devereux RB，Jem S，et al．Regression of electrocardiographic left ventricular hypertrophy during antihypertensive treatment and the prediction of major cardiovascular events〔J〕．JAMA，2004; 292: 2396-8．

2 Uechi M，Tanaka Y，Aramaki Y，et al．Evaluation of the renin-angiotensin system in cardiac tissues of cats with pressure-overload cardiac hypertrophy〔J〕．Am J Vet Res，2008; 69(3): 343-8．

3 Jiang XY，Gao GD，Du XJ，et al．The signaling of AT2 and the influence on the collagen metabolism of AT2 receptor in adult rat cardiac fibroblasts 〔J〕．Acta Cardiol，2007; 62(5): 429-38．

4 Palaniyandi SS，Nagai Y，Watanabe K，et al．Chymase inhibition reduce the progression to heart failure after autoimmune myocarditis in rats〔J〕．Exp Biol Med(Maywood)，2007; 232(9): 1213-21．

5周煥發，趙紅斌，楊銀書，等.多氯聯苯對大鼠腎臟c-fos、c-Myc和βcatenin表達影響的研究〔J〕．癌變·畸變·突變，2010; 6(11): 448-51.

〔2015-02-19修回〕

(編輯徐杰)

通訊作者:郭家娟(1978-)，女，博士，副主任醫師，碩士生導師，主要從事心血管疾病研究。

基金項目:教育部科學技術研究重點項目(211041)

〔文章編號〕1005-9202(2015)20-5751-02;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 030

〔文獻標識碼〕A

〔中圖分類號〕R544