骨髓間充質干細胞對糖尿病腎病大鼠腎臟結締組織生長因子的干預效果

張　瑞　(咸陽市第一人民醫院腎內科，陜西　咸陽　712000)

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骨髓間充質干細胞對糖尿病腎病大鼠腎臟結締組織生長因子的干預效果

張瑞(咸陽市第一人民醫院腎內科，陜西咸陽712000)

〔摘要〕目的觀察骨髓間充質干細胞(MSCs)對糖尿病大鼠腎組織纖維結締生長因子(CTGF)表達的影響。方法SD大鼠高脂高糖喂養聯合小劑量鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射建立2型糖尿病模型，并按隨機數字表法分為:糖尿病腎病對照組(DN)、干細胞移植組(MSC)、前列地爾組(AL)。非糖尿病大鼠作為正常對照組(NC)。MSCs經體外培養、鑒定、標記后，經尾靜脈注射到MSC大鼠體內(6×106MSCs/ml)，同時AL大鼠每日經尾靜脈注射10 μg·kg－1·d－1，連續注射21 d。于開始治療后第7、14、21天測定大鼠血糖、24 h尿總蛋白、血肌酐、尿素氮，采用HE染色觀察大鼠腎臟病理變化并應用免疫組化檢測腎組織CTGF蛋白的表達。結果與NC組比較，造模鼠血糖、24 h尿蛋白、肌酐、尿素氮均顯著升高(P＜0. 05); 與DN組比較，MSC組及AL組血肌酐、尿素氮、尿蛋白均顯著降低(P＜0. 05);與NC組比較，DN組腎組織CTGF表達顯著升高(P＜0. 05);與DN組比較，MSC組及AL組腎組織CTGF表達顯著降低(P＜0. 05)，但仍高于NC組(P＜0. 05);與AL組比較，MSC組血肌酐、尿素氮、尿蛋白、腎組織CTGF的表達均顯著降低(P＜0. 05)。結論MSCs可以抑制CTGF蛋白的過度表達，進而減緩DN的病程進展。

〔關鍵詞〕糖尿病腎病;骨髓間充質干細胞;結締組織生長因子

糖尿病腎病(DN)是糖尿病的主要并發癥之一，約30%的糖尿病患者會發展DN。Allard等〔1〕報道，高血糖、非酶糖基化產物和血流動力學紊亂均可刺激腎臟合成及釋放一些細胞因子，如轉化生長因子(TGF-)β、纖維結締生長因子(CTGF)等，CTGF是一種重要的促纖維化因子，在腎臟可由系膜細胞、成纖維細胞產生，CTGF的表達升高是導致DN腎纖維化的重要原因〔2〕。Semedo等〔3〕利用MSCs治療由于大部腎臟切除所致的殘余腎纖維化模型，發現MSCs能夠使體內能趨化、歸巢到受損傷組織，并且能減輕腎臟纖維化。因此本實驗擬探討MSCs對DN的治療機制。

1　材料與方法

1. 1實驗動物2只體質量為90～100 g健康雄性SD大鼠作為MSCs供鼠，54只體質量為(200±10)g雄性SD大鼠54只，清潔級(徐州醫學院實驗動物中心提供)，飼養于標準環境。自由進食，12 h光照周期。

1. 2試劑胎牛血清(FBS)購自杭州四季青，L-DMEM培養基購自北京賽默，抗鼠CD29、CD90、CD34購自Biolegend公司，5-溴脫氧尿苷嘧(BrdU)購自沃宏，鏈脲佐菌素(STZ)購自Sigma，CTGF及BrdU抗體購自Boster，前列地爾購自北京泰德制藥股份有限公司。

1. 3 MSCs的培養、鑒定和標記取90～100 g雄性SD大鼠，無菌條件下取雙側股骨、脛骨，剪去股骨、脛骨兩端，用生理鹽水反復沖洗骨髓腔，收集骨髓細胞懸浮液，1 200 r/min離心5 min后棄去上清液，在細胞沉淀中加入含10%FBS的L-DMEM培養液，混勻后接種在于25 cm2培養瓶中，37℃，5%二氧化碳(CO2)孵育箱培養。待細胞生長融合至80%～90%時進行傳代，通過反復傳代對細胞進行擴增純化。取擴增2代(P2)的大鼠MSCs，體外誘導成骨細胞，誘導21 d后行茜紅素染色鑒定鈣結節〔4〕;用流式細胞儀檢測鑒定表型抗原CD90、CD29、CD34。P3代細胞達到80%～90%融合時，加入含2%血清的BrdU終濃度為10 μmol/L的L-DMEM培養基，37℃，5%CO2孵育3 d。

1. 4造模與分組將SD大鼠采用完全隨機方法分成對照組12只和造模組42只。適應性喂養1 w后，造模組大鼠飼予高糖高脂飼料(在普通飼料的基礎上加上20%的豬油，5%的奶粉、10%的蔗糖)。喂養8 w后，造模組大鼠以35 mg/kg的劑量一次性腹腔內注射STZ(溶于0. 1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH 4. 2)，對照組大鼠按相同劑量注射檸檬酸緩沖液。STZ注射2 w后，尾靜脈取血，隨機血糖(PG)≥16. 7 mmol/L伴胰島素敏感性降低〔5〕，則DN成模。STZ注射6 w后，出現尿微量白蛋白＞30 mg/24 h尿，則DN造模成功。造模成功的SD大鼠按隨機數字表法分為: DN組、干細胞移植組(MSC組)、前列地爾組(AL組)。非糖尿病大鼠作為正常對照組(NC組)。按上述標準，實驗研究中4只造模大鼠死亡，2只不符合標準。

1. 5處理用生理鹽水將BrdU標記的P3代MSCs制成單細胞懸液，取0. 5 cm經尾靜脈注射(6×106/ml)MSCS組大鼠1次，AL組大鼠每日經尾靜脈注射劑量10 μg·kg－1·d－1，連續21 d;同時，NC組、DN組尾靜脈注射等量生理鹽水。

1. 6標本收集及檢測處理7、14、21 d將大鼠置于代謝籠內收集24 h尿液過濾后－80℃保存，以作尿蛋白定量測定。隨后稱量大鼠體重，用水合氯醛腹腔內注射麻醉，下腔靜脈采血，取血清－80℃保存待測尿素氮(BUN)及血肌酐(Scr)。剖腹后取出大鼠雙腎，用生理鹽水灌洗后，用10%中性甲醛固定，石蠟包埋，以備免疫組織化學和HE染色普通光鏡檢查。

1. 7腎臟病理檢測取10%甲醛溶液中固定的腎臟，經常規脫水、石蠟包埋、切5 μm薄片，HE染色，光鏡下觀察其形態。

1. 8免疫組織化學檢測CTGF表達將石蠟包埋的腎組織制成5 μm厚切片后行免疫組織化學分析，具體操作步驟按照試劑盒說明書進行。①切片常規脫蠟脫水，3%的雙氧水室溫孵育10 min以消除內源性過氧化物酶，雙蒸水洗5 min，3次;②抗原修復:切片浸入0. 01 mol/L檸檬酸緩沖液中用微波進行抗原修復，冷卻后PBS洗滌3次;③滴加第一抗體(一抗)即兔抗鼠CTGF，抗體(1∶50稀釋，4℃過夜)，37℃復溫30 min，PBS浸洗，3 min，2次;④次日每張切片滴加試劑一，37℃溫箱30 min，PBS浸洗3 min 2次;⑤每張切片滴加試劑二，37℃溫箱20 min。PBS浸洗，5 min 4次;⑥最后在室溫、顯微鏡下DAB顯色、觀察顯色效果，當顯色5～20 min，觀察至DAB顯色呈棕黃色時用自來水終止顯色;⑦DAB顯色終止后，再用蘇木素輕度復染、鹽酸分化、碳酸鋰返藍，依次用下列酒精梯度(75%，80%，95%，100%Ⅰ，100%Ⅱ)脫水、二甲苯透明、封片。同時采用PBS代替第一抗體的方法作為陰性對照。結果判斷:陽性著色呈棕黃色。每個標本在400倍光鏡下隨機選取8個視野，采用Olympus公司圖像采集系統進行半定量分析，染色陽性部位的深淺以平均光密度值表示。

1. 9 Brdu熒光免疫組化檢測5 μm石蠟切片，經二甲苯脫蠟，酒精脫水，1%Triton X-100室溫作用20 min，PBS洗滌3次，5 min。2NHCL變性30 min，PBS洗滌3次，5 min。1%BSA封閉1 h，滴加Brdu一抗(1∶50稀釋，4℃過夜)。37℃復溫30 min，FITC-IgG室溫1 h，甘油封片后熒光顯微鏡觀察。

1. 10統計學方法采用SPSS16. 0軟件，計量資料以x ±s表示，兩獨立樣本均數比較采用t檢驗，2組以上均數比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，方差齊者應用LSD檢驗進行組間兩兩比較，方差不齊者用Tamhane’s T2檢驗進行比較。

2　結果

2. 1 MSCs的分離純化、體外擴增、鑒定擴增第3代的大鼠MSCs，形態呈基本一致的長梭形、旋渦狀生長(圖1)。體外誘導成骨細胞鈣結節染色陽性，證明成骨細胞誘導成功(圖2)。經流式細胞儀檢測，所培養的細胞表達CD90陽性率為95. 98%，CD29陽性率為92. 93%，CD34陽性率為2. 16%。

圖1　 P3代大鼠MSCS(×200)

圖2　 P2代大鼠MSCS誘導成骨(×200)

2. 2各組大鼠PG、Scr、BUN、24 h尿蛋白比較在各時間點，DN組、MSC組及AL組PG、Scr、BUN、24 h尿蛋白較NC組明顯升高(均P＜0. 05); MSC組及AL組Scr、BUN、24 h尿蛋白較DN組顯著降低(均P＜0. 05)，與AL組比較，MSC組上述指標明顯減少，但沒有統計學意義(P＞0. 05); MSC組PG較NC組顯著減少(均P＜0. 05)，AL組BG與DN組比較沒有統計學意義(P＞0. 05)。見表1。

2. 3腎組織病理光鏡下NC組大鼠腎組織形態正常; DN組可見腎小球系膜區基質增生，系膜細胞增多，少數腎小球出現輕度硬化;腎小管壁不規則增厚，部分腎小管上皮細胞空泡變性，管腔變窄;局灶性的小管間質纖維化。MSC組、AL組上述病理改變均有不同程度的減輕(圖3)。

表1　各組大鼠PG、Scr、BUN、24 h尿蛋白比較(x ±s，n=12)

2. 4腎組織CTGF的表達NC組大鼠在腎小球、腎小管上皮細胞偶有CTGF陽性表達; DN組大鼠腎小管上皮細胞CTGF陽性表達顯著增加，腎間質區也有表達。與DN相比，MSC組和AL組，CTGF表達量均顯著減少(P＜0. 05)。見表2，圖4。

2. 5免疫熒光結果免疫熒光圖片可見標記的MSC定位在腎小球、腎小管和腎間質。見圖5。

圖3　各組3 w大鼠腎組織HE染色(×400)

表2　各時間點大鼠腎組織CTGF蛋白的表達(x ±s，n=12)

圖4　各組大鼠腎組絹CTGF(DAB，×400)

圖5　第14天BrdU免疫熒光(×400)

3　討論

DN主要病理改變特點為腎小球細胞外基質聚集、腎小球硬化及進展性腎小管間質纖維化。纖維化是糖尿病慢性并發癥的主要病理特征之一。迄今為止，其確切的發病機制尚未完全明了。除了蛋白激酶C(PKC)學說、氧化應激(OS)學說、細胞因子學說及遺傳分子學說之外，許多實驗和臨床資料均提示糖尿病腎病還存在炎細胞浸潤和細胞因子、炎癥介質水平上升，炎癥可能單獨或作為上述機制的下游環節在DN損害的發病機制中起關鍵作用〔6，7〕。其中CTGF在DN腎臟纖維化中的作用已經得到廣泛認同〔8，9〕。因此，抑制CTGF的表達可以延緩DN的進展。MSCs具有易采集且體外大量擴增并不丟失細胞核型和表面標志、可自我更新、能向多種類型細胞分化、增殖能力強并能分泌多種細胞因子〔10～12〕，因而是一種具有重要應用價值的種子細胞。本實驗利用全骨髓培養法體外培養的細胞呈貼壁生長，能誘導成為成骨細胞，并通過流式細胞儀測定其干細胞表面抗原CD90、CD29為陽性，白細胞表面特征抗原CD34為陰性，說明培養的細胞為干細胞而非同樣具有貼壁特性的白細胞，從而確保輸注前的細胞為具有分化功能的MSCs〔13，14〕。本研究將體外擴增并標記的MSCs輸注入制模成功的DN大鼠，經熒光免疫組化發現在腎臟中存在標記的干細胞，說明干細胞能定向趨化到受損的腎臟。MSC組大鼠血糖、Scr、BUN、24 h尿蛋白明顯降低;腎臟病理圖片發現與DN組比較，MSC組大鼠腎臟病變明顯減輕，說明MSCs能延緩腎臟纖維化的進程，對腎臟有明顯的保護作用;從免疫組化方法中蛋白的表達情況來看，MSCs對DN大鼠腎臟保護作用的機制可能是通過降低腎組織CTGF的表達，抑制腎組織纖維化，進而延緩DN的病程進展。

4參考文獻

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〔2014-01-07修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

·心、腦血管及代謝性疾病·

〔文章編號〕1005-9202(2015)20-5753-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 031

〔文獻標識碼〕A

〔中圖分類號〕R589

第一作者:張瑞(1988-)，女，碩士，住院醫師，主要從事糖尿病腎病研究。