多藥耐藥基因1和谷胱苷肽-S-轉移酶-π在骨軟組織肉瘤患者表達及其與化療耐藥關系

孫仁光　劉澤淼(即墨市中醫醫院骨一科，山東　即墨　266200)

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多藥耐藥基因1和谷胱苷肽-S-轉移酶-π在骨軟組織肉瘤患者表達及其與化療耐藥關系

孫仁光劉澤淼1(即墨市中醫醫院骨一科，山東即墨266200)

〔摘要〕目的探討骨軟組織肉瘤組織中多藥耐藥基因(MDR)1和谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)-π與化療耐藥的關系。方法使用免疫熒光法和流式細胞術分別檢測MDR1、GST-π的表達;采用甲基偶氮唑鹽法檢測腫瘤組織對阿奇霉素(ADM)、順鉑(DDP)、5-氟尿嘧啶(FU)、絲裂霉素(MCC)、長春新堿(VCR)及甲氨蝶呤(MTX)的敏感性。結果軟骨肉瘤組織對于ADM，DDP，5-FU，MMC，VCR，MTX的敏感率分別為53. 2%，77. 2%，51. 4%，51%，34. 6%，48. 1%。瘤體的P-gp與GST-π的相對熒光強度分別為1. 55和2. 48。P-gp的表達同ADM耐藥性，GST-π的表達同ADM，DDP，MMC耐藥性均呈顯著正相關性(P＜0. 05)。MDR1同GST-π的表達同患者基本資料無顯著相關性。術前，化療患者GST-π于升高，術前升高的患者術后復發顯著高于術前表達較低的患者。結論骨軟組織肉瘤患者MDR1、GST-π表達對化療的敏感性有個體差異，化療可導致GST-π升高，GST-π高表達與骨軟組織肉瘤耐藥有直接關系，且影響預后。

〔關鍵詞〕多藥耐藥基因1;谷胱甘肽-S;骨肉瘤;軟組織肉瘤

1山東大學齊魯醫院關節科

第一作者:孫仁光(1975-)，男，主治醫師，主要從事骨科創傷及關節疾病研究。

目前化療是治療骨軟組織肉瘤的有效手段，但多藥耐藥(MDR)往往對化療效果造成不良影響。MDR1是常見的耐藥基因，它的mRNA蛋白水平增加常見于許多腫瘤〔1〕，被公認為是介導MDR典型的途徑。P-gp可以通過能量依賴性ATP泵將化療藥物排除細胞外減少藥物在細胞內蓄積，從而形成耐藥〔2〕。腫瘤耐藥的機制復雜，常是兩種耐藥機制共同作用〔3〕，不同組織來源的腫瘤，不同病人或是不同的階段都可能有不同的機制或同一種機制不同程度的表達。骨與軟組織化療具有抗性是否同MDR1、谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)-π的表達有關尚不清楚〔4〕。本研究探討骨肉瘤細胞株和惡性骨肉瘤對常用化療藥物的敏感性分析其與MDR、GST-π表達的相關性。

1　資料與方法

1. 1一般資料2009年10月至2012年9月我院手術且術前未經任何治療的36例骨軟組織肉瘤患者。術中取部分組織進行藥敏實驗，其余置于冰箱內保存。其中男23例，女13例;年齡23～68歲，平均(34. 2±16. 5)歲。均經病理檢查確診。其中6例軟骨肉瘤，12例骨肉瘤，4例滑膜肉瘤，14例纖維肉瘤。患者術后化療，隨訪15個月以上。選取同期新輔助化療的15例患者為對照組，檢測耐藥基因，其中6例纖維肉瘤，5例骨肉瘤，4例滑膜肉瘤。術前化療方案為阿奇霉素(ADM)+順鉑(DDP)。

1. 2藥物敏感性實驗組織先使用細胞分離器調節濃度為2×105/ml。將細胞懸浮液滴入96孔板內，受試物包括ADM，DDP，絲裂霉素(MMC)，5-氟尿嘧啶(FU)，甲氨蝶呤(MTX)，長春新堿(VCR)，每組5個復孔，48 h后加入噻唑藍(MTT)(5 mg/ml，10 μl/孔)，4 h后加入10%十二烷基硫酸鈉(SDS)100 μl/孔，24 h后檢測細胞存活率，存活率＜30%表示對藥物高度敏感，30%～50%為中度敏感，51%～70%為低度敏感，＞70%為耐藥。

1. 3實時熒光定量基因擴增(FQ-PCR)檢測mRNA的表達采用Trizol試劑提取骨與軟組織肉瘤組織中的總RNA。首先取凍存組織約0. 1 g，置于研缽中并加入液氮，將其研磨至粉末樣，然后將粉末置于預冷經焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的Eppendorf管內，加入Trizol 1 ml并吹打混勻，放置5 min，加入200 μl氯仿混勻后放置2 min，12 000 r/min離心10 min，將上層水相導入另一EP管中，加入500 μl異丙醇混勻，放置10 min，12 000 r/min離心10 min，棄去上清液，在沉淀中加入75%乙醇1 ml洗2次，10 000 r/min離心10 min，棄上清，自然干燥10 min后加入DEPC水40 μl，將總RNA溶解。使用核酸蛋白定量分析儀測定RNA在260 nm及280 nm下的吸光度值，同時測定260 nm和280 nm吸光度值的比值為1. 8～2. 0，則證實RNA純度符合RT-PCR反應要求。采用一步法進行FQ-PCR檢測，MDR1，GST-π引物和探針均選自上海生工生物工程公司，β-actin引物和探針為ABI公司生產。RT-PCR反應為25 μl，含總量為RNA 200 ng(5 μl)，RT混合物0. 25 μl，2×RT-PCR混合物12. 5 μl，β-actin引物及探針各為1. 5 μl。RT-PCR條件: 50℃下30 min，95℃下15 min，40個循環后在4℃下60 min。采用SDS軟件分析循環次數(Ct)，mRNA的表達。△Ct=MDR1或GST-π孔中Ct值－β-actin孔Ct值。

1. 4流式細胞儀(FCM)檢測蛋白表達將細胞值濃度調為1×106/ml，并設置a，b，c，d 4個管，細胞懸浮液為100 μl/管。a，b管中加入藻紅蛋白(PE)標記P-gp鼠抗人單抗，同型對照各10 μl，暗處反應30 min檢測。其余細胞經過1%多聚甲醛固定5 min后，再以1%的牛血清白蛋白PBS清洗2次，再加入通透液500 μl，室溫下作用10 min使用PBS進行洗滌。c管中加入鼠抗人IgG抗體10 μl，d管中加入鼠抗人GST-π單抗10 μl，室溫反應30 min再以PBS洗滌，再加入二抗異硫氰酸熒光素標記抗小鼠IgG單抗5 μl，室溫下避光反應30 min后待檢測。單抗和FACScalibur型流式細胞儀選自美國B-D公司。蛋白表達采用相對熒光強度表示。

1. 5統計學方法采用SPSS18. 0統計軟件進行單因素方差分析，χ2檢驗。

2　結果

2. 1藥物的敏感性檢測結果不同患者對于藥物敏感性差異較大，其中對于DDP的敏感率(77. 2%)最高，其次為ADM(53. 2%)、5-FU(51. 4%)、MMC(51. 0%)、MTX(48. 1%)、VCR(34. 6%)。耐藥率依次為VCR 65. 4%、MTX 51. 9%、MMC 49. 0%、5-FU 48. 6%、ADM 36. 8%、DDP 22. 8%。

2. 2 P-gp、GST-π與藥物敏感性的關系P-gp和GST-π蛋白表達見圖1、圖2。P-gp的表達同ADM耐藥性呈正相關(χ2= 9. 442，P＜0. 005)，GST-π的表達同ADM，DDP，MMC耐藥性呈顯著正相關性(χ2= 6. 216，8. 023，9. 722，P＜0. 05)。同其他化療藥物耐藥與否無關。

2. 3 MDR1及GST-π表達同臨床病理因素及預后的關系瘤組織MDR1表達低，GST-π的表達較高，且MDR1，GST-π的表達同患者年齡，性別病理類型及腫瘤大小無關(P＞0. 05)。術前化療患者GST-π升高，術后復發者GST-π水平高于無復發者。見表1。

圖1　腫瘤組織P-gp表達

圖2　腫瘤組織GST-π表達

表1　 MDR1及GST-π表達同臨床病理因素及預后的關系(x±s)

3　討論

骨軟組織肉瘤患者對放化療藥物均具有抗藥性。近年來，隨著細胞增殖動力學、微小轉移灶等腫瘤生物學的研究進展，輔助性化療已逐漸應用于骨軟組織肉瘤患者的治療中。由于不同個體的腫瘤存在顯著性差異，即同一組織學類型、分化程度相同的腫瘤，對同一藥物和不同藥物的敏感性不同及多重耐藥性等因素的影響，使其療效受到制約。因不同骨軟組織肉瘤細胞對化療藥物可產生不同的反應，術后依據病理學腫瘤細胞壞死程度確定化療敏感性僅能對所應用化療藥物進行綜合整體評價，但不能明確是哪一種藥物的治療效果最好。多種基因及其表達產物均對腫瘤化療的敏感性造成影響，即可能與造成患者耐藥性的相關。

目前對腫瘤組織中P-gp表達同患者預后的相關性并無統一定論，有研究認為P-gp高表達是骨肉瘤復發的高危因素〔5，6〕，研究〔7〕報道，P-gp是位于細胞膜上的一類由MDR1基因編碼的一種能量依賴性轉運蛋白。其MDR機制為，化療藥物進入腫瘤細胞后，P-gp可同時與多種化療藥物集合，通過腺苷三磷酸(ATP)依賴型藥物泵將化療藥物排出細胞，從而阻礙藥物的作用，即造成腫瘤細胞的耐藥性。Baldini等〔8〕研究發現，P-gp高表達患者的生存率明顯低于低表達患者，而Ling〔9〕研究同樣發現P-gp高表達患者的預后較差，復發率高。而本文未發現MDR1水平與復發有關，不能說明MDR1基因同骨軟組織肉瘤預后有關。

GST-π是GSTs家族的主要成員，有學者〔10〕認為GST-π過表達者預后不良，而另有學者〔11〕認為GST-π的表達情況與預后無關。有研究顯示無局部淋巴結轉移和遠處轉移原發滑膜肉瘤患者中，GST-π的陽性率同患者性別，年齡，腫瘤位置，活性大小，化療反應等無明顯關系〔12〕，結果與本文一致。本文說明GST-π水平同預后存在關系，是預后的重要因素。對于ADM耐藥的患者可以大量檢測到P-gp。同時GST-π同ADM，DDP，MMC的耐藥程度呈正相關。化療可能會引起GST-π的表達上調。

4參考文獻

1 Tan B，Li Y，Zhao Q，et al．Inhibition of Vav3 could reverse the drug resistance of gastric cancer cells by downregulating JNK signaling pathway 〔J〕．Cancer Gene Ther，2014; 21(12): 526-31.

2 Liu X，Chen L，Feng B，et al．Reversing effect of sorcin in the drug resistance of human nasopharyngeal carcinoma〔J〕．Anat Rec(Hoboken)，2014; 297(2): 215-21.

3顏昕，阮文雯，王效民，等.多藥耐藥對肝癌細胞增殖、凋亡、侵襲活性、耐藥機制及絲裂原活化蛋白激酶表達的影響〔J〕．腫瘤，2012; 32(7): 507-15.

4李偉，賀艷，張世權，等.抑凋亡蛋白Survivin及P-糖蛋白在骨肉瘤中的表達與骨肉瘤化療耐藥性關系的研究〔J〕．海南醫學，2012; 23(6): 1-3.

5趙明靜，馬列，王群，等.耐順鉑相關基因MDR1、MRP、LRP及GST-π在非小細胞肺癌中的表達及與生存相關的Meta分析〔J〕．現代腫瘤醫學，2012; 20(8): 1596-600.

6 Zhao X，Bai Z，Wu P，et al．S100P enhances the chemosensitivity of human gastric cancer cell lines〔J〕．Cancer Biomark，2013; 3(1): 1-10.

7 Li WJ，Zhong SL，Wu YJ，et al．Systematic expression analysis of genes related to multidrug-resistance in isogenic docetaxel-and adriamycin-resistant breast cancer cell lines〔J〕．Mol Biol Rep，2013; 40(11): 6143-50.

8 Baldini N，Scotlandi K，Barbanti-Bródano G，et al．Expression of P-glycoprotein in high-grade osteosarcomas in relation to clinical outcome〔J〕．N Engl J Med，1995; 333(21): 1380-5．

9 Ling V．Does P-glycoprotein predict response to chemotherapy〔J〕．J Natl Cancer Inst，1989; 81(2): 84-5．

10 Zhang Y，Zhou T，Duan J，et al．Inhibition of P-glycoprotein and glutathione S-transferase-pi mediated resistance by fluoxetine in MCF-7/ADM cells〔J〕．Biomed Pharmacother，2013; 67(8): 757-62.

11李勇，范立僑，檀碧波，等.胃癌原發灶和區域淋巴結轉移灶中ZNF139與MRP-1、MDR1/P-gp、GST-π的表達及關系〔J〕．中華普通外科雜志，2014; 29(10): 801-2.

12 Liu X，Ma T，Qu B，et al．Pesticide-induced gene mutations and Parkinson disease risk: a meta-analysis〔J〕．Genet Test Mol Biomarkersl，2013; 17(11): 826-32.

〔2014-07-19修回〕

(編輯苑云杰)

基金項目:青島市中醫科研計劃項目(No．2013-zyy032)

〔文章編號〕1005-9202(2015)20-5823-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 067

〔文獻標識碼〕A

〔中圖分類號〕R446