CTHRC1對結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

王　成　袁麗萍　殷　麟　張成武　(青海大學附屬醫院胃腸腫瘤外科，青?！∥鲗帯?10001)

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CTHRC1對結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

王成袁麗萍殷麟張成武(青海大學附屬醫院胃腸腫瘤外科，青海西寧810001)

〔摘要〕目的觀察膠原三股螺旋重復蛋白(CTHRC)1對結直腸癌HT29細胞增殖、遷移和侵襲的影響。方法采用RT-PCR和免疫組織化學方法檢測結直腸癌組織中CTHRC1的表達情況。采用電穿孔轉染法，將pcDNA3. 1-CTHRC1和CTHRC1 siRNA轉染HT29細胞中，通過克隆形成實驗檢測CTHRC1對HT29細胞增殖的影響;通過傷口愈合實驗和Boyden小室檢測CTHRC1對HT29細胞遷移和侵襲能力的影響。結果RT-PCR和免疫組織化學檢測顯示，CTHRC1在結直腸癌組織中的表達顯著高于正常對照組織。增殖、遷移和侵襲實驗結果顯示，對照組、轉染CTHRC1和轉染CTHRC1 siRNA的結直腸癌HT29細胞克隆形成數分別為(147. 34±15. 86)、(234. 17±27. 86)和(66. 03±8. 95);傷口寬度百分比分別為(1. 00± 0. 00)、(0. 37±0. 12)和(1. 48±0. 35);發生侵襲的細胞數分別為(201. 24±33. 54)、(415. 36±45. 63)和(96. 13±15. 46);轉染CTHRC1可顯著促進結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力;而轉染si-CTHRC1可顯著抑制結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。結論CTHRC1可明顯增加HT29細胞增殖、遷移和侵襲能力，這可能是CTHRC1參與結直腸癌發生發展的機制。

〔關鍵詞〕膠原三股螺旋重復蛋白1;結直腸癌;增殖;遷移;侵襲

盡管結直腸癌的診斷和治療手段目前都有顯著提高，然而手術和化療的療效仍然不能令人滿意〔1，2〕。膠原三股螺旋重復蛋白(CTHRC)1是一種分泌性糖蛋白，大鼠動脈球囊損傷時，血管外膜成纖維細胞和血管內膜平滑肌細胞CTHRC1的表達顯著升高〔3〕。此外研究發現，CTHRC1在多種腫瘤中存在異常的表達，包括黑色素瘤、胃腸道癌、乳腺癌、甲狀腺癌、肝癌和胰腺癌〔4～9〕。CTHRC1過表達可通過促進細胞遷移和抑制膠原基質合成而促進損傷組織修復〔10〕。而關于CTHRC1對結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲能力影響的研究還不是很多。本研究擬觀察CTHRC1對HT29細胞增殖、遷移和侵襲的影響。

1　材料與方法

1. 1臨床資料選取2012年12月30日至2013年12月30日在我科住院并行手術治療的結直腸癌患者20例?；颊咝g前

均未接受化學治療、放射治療或免疫治療，收取患者癌組織標本，同時收集10例患者癌旁組織標本作為對照。組織標本離體后10 min內凍存于液氮中保存。每例樣本均經過組織病理學診斷證實為結直腸癌。20例患者的平均年齡為(60. 1± 13. 9)歲。

1. 2細胞及試劑人結直腸癌細胞系HT29購自ATCC，細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中。轉染試劑購自Lonza公司;侵襲實驗用Boyden小室購自美國Millipore公司。1. 3 RT-PCR Trizol提取細胞總RNA，反轉錄成cDNA。PCR反應條件: 95℃5 min，95℃10 s，60℃20 s，共40個循環。CTHRC1上游引物: 5'-GCATGCTGTCAGCGTTGGTA-3';下游引物: 5'-TCAATGGGAAGAGGTCCTGAA-3'。以2-△△Ct方法計數基因的相對表達量。

1. 4免疫組化染色免疫組織化學染色標本采用甲醛固定、石蠟包埋的組織進行，具體操作方法參見文獻〔2〕報道。

1. 5電穿孔轉染法嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1. 6克隆形成實驗轉染pcDNA3. 1-CTHRC1和CTHRC1 siRNA的HT29細胞各5×103接種于6孔板中，培養72 h后，形成的克隆用甲醇固定，并用含0. 1%結晶紫的20%甲醇染色30 min，計數形成的克隆數。

1. 7遷移和侵襲能力檢測采用傷口愈合實驗方法檢測細胞遷移能力，具體操作方法參見文獻〔11〕報道。采用Boyden小室分析檢測細胞侵襲能力:用于實驗的細胞采用臺盼藍染色計數并重懸。將1×105個細胞置于經過鋪膠的上層小室中，并補加培養基至300 μl。下層小室中加入含10%胎牛血清的培養基500 μl。孵育12 h后，未發生侵襲的細胞用棉拭子從上層腔室除去。下層小室中的細胞以0. 1%結晶紫固定染色，計算出現侵襲的細胞數。

1. 8統計學方法采用SPSS16. 0軟件行t檢驗。

2　結果

2. 1 RT-PCR和免疫組織化學方法檢測CTHRC1在結直腸癌組織中的表達CTHRC1在結直腸癌組織中的表達顯著高于正常對照組織。見圖1。

圖1　 CTHRC1在結直腸癌組織中的表達情況

2. 2克隆形成實驗檢測CTHRC1對結直腸癌細胞增殖能力的影響對照組、轉染CTHRC1和轉染CTHRC1 siRNA的結直腸癌HT29細胞克隆形成數分別為(147. 34±15. 86)、(234. 17± 27. 86)和(66. 03±8. 95)，轉染CTHRC1可顯著促進結直腸癌細胞的增殖能力;而轉染si-CTHRC1可顯著抑制結直腸癌細胞的增殖能力。見圖2。

圖2　 CTHRC1對結直腸癌細胞增殖能力的影響

2. 3傷口愈合實驗檢測CTHRC1對結直腸癌細胞遷移能力的影響對照組、轉染CTHRC1和轉染CTHRC1 siRNA的結直腸癌HT29細胞在培養24 h后，傷口寬度百分比分別為(1. 00± 0. 00)、(0. 37±0. 12)和(1. 48±0. 35)，轉染CTHRC1可顯著促進結直腸癌細胞的遷移能力;而轉染si-CTHRC1可顯著抑制結直腸癌細胞的遷移能力。見圖3。

2. 4 Transwell檢測CTHRC1對結直腸癌細胞侵襲能力的影響

對照組、轉染CTHRC1和轉染CTHRC1 siRNA的結直腸癌HT29細胞發生侵襲的細胞數分別為(201. 24±33. 54)、(415. 36±45. 63)和(96. 13±15. 46)，轉染CTHRC1可顯著促進結直腸癌細胞的遷移能力;而轉染si-CTHRC1可顯著抑制結直腸癌細胞的遷移能力。見圖4。

圖3　 CTHRC1對結直腸癌細胞遷移能力的影響

圖4　 CTHRC1對結直腸癌細胞侵襲能力的影響

3　討論

CTHRC1是一個25 kD的分泌性糖蛋白，在多種腫瘤中存在異常的表達〔4～9〕，本研究發現，CTHRC1在結直腸癌組織中的表達較癌旁組織相比顯著升高，提示CTHRC1的高表達與結直腸癌的發生發展密切相關。進一步研究發現，CTHRC1與結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲密切相關。過表達CTHRC1的HT-29細胞增殖、遷移和侵襲能力均顯著升高，而敲低CTHRC1 的HT-29細胞增殖、遷移和侵襲能力均顯著降低。上述結果提示，結直腸癌組織中高表達的CTHRC1可通過促進結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲參與結直腸癌的發生和發展。

綜上所述，CTHRC1在結直腸癌組織中的表達顯著上調，且上調表達的CTHRC1參與了結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲。初步提示，CTHRC1表達異常參與了腫瘤的發生發展，包括結直腸癌。然而，目前關于CTHRC1發揮作用的分子機制尚未被完全研究清楚。近期研究發現CTHRC1可通過穩定Wnt受體復合物以選擇性地激活Wnt信號通路〔12〕。在腫瘤中，CTHRC1可通過激活Wnt/PCP-Rho信號通路促進胃腸道間質瘤侵襲。然而，在結直腸癌的發生發展中CTHRC1通過何種通路調節結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲將是未來我們研究的重點。

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〔2015-04-17修回〕

(編輯滕欣航)

通訊作者:張成武(1963-)，男，教授，碩士生導師，主要從事胃腸腫瘤研究。

〔文章編號〕1005-9202(2015)20-5833-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 072

〔文獻標識碼〕A

〔中圖分類號〕R735

第一作者:王成(1971-)，男，碩士，副主任醫師，主要從事胃腸腫瘤研究。