黑曲霉產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵條件的優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)研究

張曈 劉曉燕 許家興 李登超 羊燕燕

（江蘇省生物質(zhì)能與酶技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇省區(qū)域現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與環(huán)境保護(hù)協(xié)同創(chuàng)新中心 淮陰師范學(xué)院 江蘇淮安 223300）

黑曲霉產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵條件的優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)研究

張曈 劉曉燕 許家興 李登超 羊燕燕

（江蘇省生物質(zhì)能與酶技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇省區(qū)域現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與環(huán)境保護(hù)協(xié)同創(chuàng)新中心 淮陰師范學(xué)院 江蘇淮安 223300）

本文用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法對(duì)黑曲霉B3菌株產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定了黑曲霉B3產(chǎn)纖維素酶的最優(yōu)條件：小麥秸稈2.5%，酵母膏2.0%，MgSO40.1%，KH2PO40.1%，pH 6.3，31.58℃，發(fā)酵時(shí)間73.08h，接種量為8.004%，150 r/m in振蕩培養(yǎng)，此條件下黑曲霉B3發(fā)酵液的FPA酶活力為153.4 U/m L。將粗酶液初步純化后，對(duì)純化纖維素酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究，確定了其最適溫度為60℃，最適pH值為6.0，Ca2+、Li+、K+等金屬離子對(duì)其有激活作用，苯甲基磺酰氟（PMSF）對(duì)該酶強(qiáng)烈抑制，該酶對(duì)底物CMC的Km值和Vmax分別是24.0mg/m L和0.09mg/min。

黑曲霉；纖維素酶；液體發(fā)酵；優(yōu)化；響應(yīng)面法

纖維素酶是降解纖維素生成葡萄糖的一種復(fù)合酶,主要包括內(nèi)切葡聚糖酶、外切β-1,4-葡聚糖酶和纖維二糖水解酶。利用纖維素酶可開發(fā)豐富的纖維素資源,纖維素酶在生物質(zhì)能源、秸稈綜合利用、可再生資源、食品、飼料、釀造等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用前景[1～3]。然而，就目前而言，纖維素資源的利用率低，同時(shí)還會(huì)對(duì)環(huán)境會(huì)造成一定污染。因此，如何成功的開發(fā)這一資源，對(duì)解決人類面臨的能源問題、環(huán)境問題、可持續(xù)發(fā)展都具有非常重要的意義[4]。

通過纖維素酶降解纖維素的研究和應(yīng)用進(jìn)展快速，商業(yè)化程度較高[5]。纖維素酶的工業(yè)化生產(chǎn)可分為固體發(fā)酵法和液體深層發(fā)酵法，液體深層發(fā)酵法的培養(yǎng)條件不易污染雜菌，容易控制，生產(chǎn)效率也較高，被國(guó)內(nèi)外重要的研究和生產(chǎn)工藝廣泛應(yīng)用[6-7]。黑曲霉作為一種自然界中常見的絲狀真菌，是公認(rèn)安全的真核微生物。用其生產(chǎn)酶制劑安全、高效、無毒素產(chǎn)生，而且黑曲霉生長(zhǎng)期短，產(chǎn)酶速度快，生產(chǎn)的纖維素酶主要分泌到細(xì)胞外，便與純化[8]。發(fā)酵條件的優(yōu)化是當(dāng)前增加纖維素酶活力、提高產(chǎn)酶量的主要途徑之一[9]。對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化一般采用單因素優(yōu)化和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，但它們都有一定的局限性，無法直接找到區(qū)域中各個(gè)因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值[10]。借助design expert統(tǒng)計(jì)軟件能迅速、可靠、簡(jiǎn)易地進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)的安排和數(shù)據(jù)分析，從而找出微生物培養(yǎng)條件的最佳組成[11]。本文利用design expert8.06軟件對(duì)黑曲霉產(chǎn)纖維素酶的液體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并將最優(yōu)條件下生產(chǎn)得到的纖維素酶進(jìn)行初步純化，研究其酶學(xué)性質(zhì)，為黑曲霉大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶和纖維素酶在生產(chǎn)中的應(yīng)用打下理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

黑曲霉B3菌株，實(shí)驗(yàn)室保藏

1.1.2 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基（平板、斜面）:馬鈴薯20g,葡萄糖2g,瓊脂2g,PH自然種子培養(yǎng)基：PDA液體培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基[13]：液體發(fā)酵培養(yǎng)基(質(zhì)量分?jǐn)?shù)):碳源5%、氮源1%、KH2PO40.05%、Mg SO47H2O 0.05%。

將上述所有培養(yǎng)基均在1.0×10Pa、121℃滅菌30min。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)

種子活化：在平板上劃線，挑取單菌落接種到斜面培養(yǎng)基中，置于30℃培養(yǎng)4～5 d。種子液培養(yǎng)：250mL三角瓶裝入種子培養(yǎng)基50mL，接入菌種三環(huán),轉(zhuǎn)速150r/min，30℃下振蕩培養(yǎng)72h～168h。

發(fā)酵培養(yǎng)：5%～10%接種量，28℃～32℃，150r/min振蕩培養(yǎng)60h～96h，制備粗酶液。

1.2.2 粗酶液制備

發(fā)酵液先初步過濾，再經(jīng)5000r/min離心10min，上清液即為粗酶液。酶活測(cè)定時(shí)需用磷酸緩沖液做適當(dāng)稀釋。

1.2.3 酶活測(cè)定

1.2.3.1 羧甲基纖維素酶活（CMC）測(cè)定

實(shí)驗(yàn)組加入適當(dāng)稀釋的粗酶液0.5mL和0.5%CMC溶液1.5mL，空白對(duì)照管中加入2.0mL 0.5%CMC溶液。60℃水浴保溫30min。向試管中加入3.0mLDNS試劑，沸水浴10min，540 nm測(cè)吸光值。酶活力單位規(guī)定：每mL酶液1min水解底物產(chǎn)生1m g葡萄糖的酶活力為1個(gè)活力單位(U/mL)。

1.2.3.2 濾紙酶活（FPA）測(cè)定

實(shí)驗(yàn)組取適當(dāng)稀釋的粗酶液0.5m l，加入PH 4.0的檸檬酸緩沖液1m l，空白對(duì)照組加入PH 4.0的檸檬酸緩沖液1.5ml，將實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組中在60℃水浴中預(yù)熱2～3min，再在每個(gè)管子內(nèi)加入50mg的濾紙條30min后加入3mlDNS試劑，立即轉(zhuǎn)入沸水浴5min后，浸入冷水快速冷卻，在540 nm測(cè)定吸光值。每mL酶液1min水解底物產(chǎn)生1m g葡萄糖的酶活力為1個(gè)活力單位(U/mL)。

1.2.4 黑曲霉B3產(chǎn)纖維素酶條件優(yōu)化

前期通過單因素實(shí)驗(yàn)來確定發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳的碳源、氮源、培養(yǎng)溫度和最佳產(chǎn)酶時(shí)間，以便得到最有利于產(chǎn)酶的培養(yǎng)條件。

后期在初步優(yōu)化的產(chǎn)酶培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，通過design expert8. 06軟件來進(jìn)行設(shè)計(jì)，利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)從經(jīng)初步優(yōu)化的培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件中篩選出對(duì)酶活具有顯著影響的3個(gè)因素，之后針對(duì)這3個(gè)顯著影響因素以及它們的正負(fù)效應(yīng)進(jìn)行設(shè)計(jì)，利用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)逼近響應(yīng)值（最大酶活力區(qū)域），最后用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)。通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合響應(yīng)面模型，最終確定最優(yōu)產(chǎn)酶條件，并進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.5 纖維素酶的分離純化

發(fā)酵液使用硫酸銨分級(jí)沉淀，將40%-50%濃度沉淀部分（含有纖維素酶活部分）使用14kD的透析袋進(jìn)行透析；透析液在濃縮儀上濃縮后采用SephadexG75進(jìn)行凝膠過濾，活性部分使用陽離子交換柱進(jìn)一步純化。脫鹽后能夠得到純度較高的纖維素酶組分。

1.2.6纖維素酶酶學(xué)性質(zhì)研究

對(duì)纖維素酶進(jìn)行酶學(xué)的理化性質(zhì)研究，測(cè)算纖維素酶的酶活力、最適酶活溫度、pH值、酶失活的溫度范圍，以及酶的米氏常數(shù)和最大反應(yīng)速度等具體生化指標(biāo)。

2 結(jié)果與討論

2.1 黑曲霉B3產(chǎn)纖維素酶條件的優(yōu)化

通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)（圖1）分析結(jié)果表明，優(yōu)化后的產(chǎn)纖維素酶液體發(fā)酵條件為：小麥秸稈2.5%，酵母膏2.0%，MgSO40.1%，KH2PO40.1%，pH 6.3，31.58℃，發(fā)酵時(shí)間73.08h，接種量為8.004%，150r/min振蕩培養(yǎng)。在此條件下，做3組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到濾紙酶活力的平均值為153.4U/m l，比初始酶活力73.5U/m l提高了108%。

2.2 纖維素酶的初步純化

在利用Sephadex G75凝膠柱純化纖維素酶的過程中，每一步都測(cè)定洗脫液的纖維素酶活力和總蛋白含量，確定純化過程中纖維素酶回收率和純化程度，結(jié)果見表1。純化后的纖維素酶與粗酶液對(duì)比，純化倍數(shù)2.4倍，回收率43.2%。

表1 纖維素酶的純化步驟

2.3 純化的纖維素酶酶學(xué)性質(zhì)的研究

2.3.1 純化纖維素酶的最適反應(yīng)溫度

將純化的纖維素酶樣品分別在30.0、35.0、40.0、45.0、50.0、55.0、60.0、65.0、70.0、75.0、80.0℃下測(cè)定其酶活，結(jié)果如圖2所示，從圖中可以看出，純化纖維素酶在60℃時(shí)酶活力最高，具有一定的熱穩(wěn)定性。

圖2 純化纖維素酶的最適溫度（■）和溫度穩(wěn)定性（◆）

2.3.2 純化纖維素酶的最適反應(yīng)pH值

將純化的纖維素酶在不同pH（4.0～9.0）下測(cè)定其酶活，結(jié)果如圖3所示，從圖中可以看出此菊粉酶在pH值為6.0時(shí)酶活達(dá)到最高，酶活力在pH5.5～7.0之間保持穩(wěn)定。

圖3 pH值對(duì)純化的纖維素酶活力（◆）與穩(wěn)定性（■）的影響

圖4 不同金屬離子對(duì)纖維素酶活性的影響

2.3.4 蛋白抑制劑對(duì)純化纖維素酶酶活的影響

將純化的纖維素酶加入碘乙酸、EDTA（乙二胺四乙酸）、EGTA（乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸）、SDS（十二烷基磺酸鈉）和PMSF（苯甲基磺酰氟）等蛋白抑制劑后在4℃下放置30min，測(cè)定酶活，結(jié)果如圖5所示。從圖中可以看出，當(dāng)存在EDTA時(shí)，由于EDTA將金屬離子螯合，對(duì)纖維素酶活力有一定影響，但不會(huì)被完全抑制。而纖維素酶在PMSF存在時(shí)酶活力大幅下降，抑制效果非常明顯。PMSF能專一性作用于絲氨酸，這表明我們純化纖維素酶的活性中心可能含有絲氨酸殘基。

圖5 不同酶抑制劑對(duì)纖維素酶活性的影響

2.3.5 米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度Vmax

通過在不同濃度底物CMC溶液中測(cè)定纖維素酶的反應(yīng)速度來確定纖維素酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km和Vmax，利用雙倒數(shù)作圖法以1/[S]為橫坐標(biāo)，1/V為縱坐標(biāo)作圖6，利用圖6計(jì)算纖維素酶對(duì)底物CMC的

圖6 雙倒數(shù)法作圖求Km和Vmax

米氏常數(shù)Km為24.0mg/mL，最大反應(yīng)速度Vmax是0.09mg/min。

3 結(jié)語

本文用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法對(duì)黑曲霉B3菌株產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定了黑曲霉B3產(chǎn)纖維素酶的最優(yōu)條件：小麥秸稈2.5%，酵母膏2.0%，MgSO40.1%，KH2PO40.1%，pH 6.3，31.58℃，發(fā)酵時(shí)間73.08h，接種量為8.004%，150 r/min振蕩培養(yǎng)，此條件下黑曲霉B3發(fā)酵液的FPA酶活力為153.4U/mL，比初始酶活力73.5U/ml提高了108%。將粗酶液初步純化后，對(duì)純化纖維素酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究，確定了其最適溫度為60℃，最適pH值為6.0；Ca2+、Co2+、Zn2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+、Li+、Na+、Cu2+和K+（1.0mM）對(duì)纖維素酶酶活有一定的促進(jìn)作用，而Mg2+、Ag+、Hg2+（1.0mM）則對(duì)纖維素酶有抑制作用；蛋白抑制劑苯甲基磺酰氟（PMSF）對(duì)纖維素酶具有強(qiáng)烈抑制作用；利用雙倒數(shù)做圖法法計(jì)算纖維素酶對(duì)底物CMC的米氏常數(shù)為24.0mg/mL，最大反應(yīng)速度為0.09mg/min。

本文通過對(duì)黑曲霉產(chǎn)纖維素酶條件的優(yōu)化以及對(duì)纖維素酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，為黑曲霉纖維素酶的發(fā)酵生產(chǎn)提供了理論基礎(chǔ)，為秸稈的預(yù)處理和秸稈纖維素乙醇的生產(chǎn)提供了一條新的纖維素酶來源，具有一定的應(yīng)用前景。

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張曈（1981—），男，山東泰安，博士，講師，主要研究方向?yàn)樯镔|(zhì)能源。

國(guó)家自然科學(xué)青年基金（21406083）；江蘇省自然科學(xué)青年基金（BK20130416）；淮安市科技支撐計(jì)劃（HAG2011015）。