單一方式復制膝骨關節炎動物模型的特點與局限性分析

段文秀，胡　玲,2，吳子建,2，龔長萍，許　靜，李前輝，王　潔,2

(1.安徽中醫藥大學，安徽 合肥　230038；2.安徽中醫藥大學針灸經絡研究所，安徽 合肥　230038)

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單一方式復制膝骨關節炎動物模型的特點與局限性分析

段文秀1，胡玲1,2，吳子建1,2，龔長萍1，許靜1，李前輝1，王潔1,2

(1.安徽中醫藥大學，安徽 合肥230038；2.安徽中醫藥大學針灸經絡研究所，安徽 合肥230038)

[摘要]單一方式復制的膝骨性關節炎(knee osteoarthritis，KOA)動物模型主要包括自發性KOA動物模型和實驗誘導性KOA動物模型。自發模型包括自然發生模型和轉基因模型。實驗誘導性KOA模型主要包括化學模型和機械模型。每種模型復制方法均存在一定的優勢和不足，需要結合實驗需要選擇適宜的動物和適當的模型復制方法，并對模型復制方法進行反復操作，必要時可以根據實驗需要對模型復制方法進行改良。

[關鍵詞]膝骨性關節炎；動物模型；單一方式

膝骨性關節炎(knee osteoarthritis，KOA)是一種累及膝關節的慢性退行性關節疾病，主要表現為膝關節疼痛和活動障礙。隨著人口老齡化的推進，人口結構特征的改變，KOA的發病人數也呈遞增趨勢，這種發病趨勢將給社會帶來巨大的醫療負擔[1]。創傷、機械因素、炎癥都會引起KOA。此外年齡、代謝異常以及內分泌疾病等也可能影響KOA的進展。關節軟骨退行性病變是KOA病理改變的核心環節。此外，病理改變還涉及到軟骨下骨、關節囊、滑膜、滑液等。KOA動物模型的復制可以分為單一方式模型和復合模型。單一方式模型應用廣泛，筆者綜述近年來單一方式復制KOA動物模型研究的概況，分析其造成KOA的機制，并對不同模型的特點及其局限性進行探討。

單一方式復制的KOA動物模型主要包括自發性KOA動物模型和實驗誘導性KOA動物模型。自發模型包括自然發生模型和轉基因模型。實驗誘導性KOA模型主要包括化學模型和機械模型。化學模型是通過關節腔內注射藥物或者全身給藥方式引起關節內成分代謝發生改變來誘發關節軟骨改變。機械模型通過手術和關節固定改變關節應力分布，并通過引起滑液成分改變的機制誘發關節退行性病變。

1自發性模型

自發性模型指基本在自然條件下獲得，未經過刻意的人工處理的KOA模型，包括自然發生模型和轉基因模型。

1.1自然發生的KOA模型一些實驗室動物，如豚鼠、敘利亞倉鼠、狗和非人靈長類動物可以形成自發KOA，以Hartley豚鼠模型應用較多。McDougall等[2]研究發現Hartley豚鼠約3個月可在脛骨平臺中間形成對稱的病灶。梁震等[3]研究發現雌性Hartley豚鼠90 d時其關節軟骨有中度以上的損害，210 d的豚鼠關節軟骨進一步被破壞，有明顯的KOA表現。

1.2轉基因模型由于小鼠的基因及可標記基因已被很好的注釋、翻譯，因此，KOA的轉基因模型常選用小鼠。KOA的轉基因模型的一些范例包括STR/ORT小鼠，其表現出增加的氧化應激以至誘導KOA[4]。過量的組織蛋白酶K會導致骨關節炎的缺陷，基質金屬-13的表達也可以誘導軟骨破壞[5]。Salminen等[6]研究發現Del1轉基因小鼠3個月時膝關節關節軟骨形成表淺原纖維，繼而引起軟骨硬化、半月板退變及軟骨下骨裸露等KOA病變。

自發性KOA動物模型成功率高，軟骨形態學改變與年齡和體質量相關聯，病理改變過程最接近人類KOA的自然過程。該模型在研究KOA的病因及軟骨病理改變等方面有優勢。自發性模型常以鼠類為模型動物，而在研究KOA鼠模型時應注意，鼠的關節幾何形狀與人類稍有不同；另外鼠類關節軟骨不含硫酸角質素，而人類關節軟骨內此物質隨年齡而增多，以鼠類為KOA模型動物時，在分析結果時應考慮該方面的差異。轉基因模型主要以小鼠模型為主，小鼠與人類的基因譜差異較大，因而并不能完全模擬人類KOA。且小鼠只能獲取少量組織學標本，不利于對其進行組織學的研究。自發性模型發展緩慢，時間周期較長，價格較高等也是限制其在動物實驗中應用的因素。

2誘導性KOA模型

誘導性KOA模型主要包括化學模型和機械模型。其中，化學模型的誘導方式可分為關節腔內注射藥物和全身給藥。機械模型的誘導方式有關節外手術、關節內手術和關節固定術。

2.1化學模型化學模型的復制方法包括關節腔內注射藥物和全身給藥。其通過藥物直接或間接作用于關節軟骨的機制引起KOA。關節腔內注射的藥物主要有木瓜蛋白酶和膠原酶；全身給藥的常用藥物為喹諾酮類抗生素。

2.1.1木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶通過水解軟骨細胞外基質中蛋白多糖，分離硫酸軟骨素、硫酸角質素等機制直接對關節軟骨進行損傷。Patel等[7]將0.2 mL的4%木瓜蛋白酶與0.1 mL的0.03 mmol/L半胱氨酸在關節內3次注射(第1、4、7天)以誘導KOA。韓冠英等[8]用不同濃度的木瓜蛋白酶與L-半胱氨酸構成的混合溶液注入兔膝骨關節腔內，制備出病理表現嚴重程度不同的兔KOA模型。段文秀等[9]用0.15 mL的木瓜蛋白酶溶液與左旋半胱氨酸混合溶液注入SD大鼠膝關節腔，4周后造成早期骨關節炎模型。孫魯寧等[10]在實驗第1天抽取0.1 mL的4%木瓜蛋白酶溶液注入兔膝關節腔內，并在實驗的第4天和第7天按照同樣的方式重復注射，以此復制兔KOA模型。

2.1.2膠原酶膠原酶通過特異性地水解天然膠原蛋白的螺旋結構的機制直接破壞關節軟骨。鄧宇等[11]將0.5 mL的Ⅱ型膠原蛋白酶溶液注入兔膝關節腔內復制兔KOA模型。Botter SM等[12]將10 μL Ⅶ型膠原酶注射小鼠膝關節誘導出KOA模型，以此來觀察軟骨下骨表型的差異如何影響軟骨損傷的發展。

2.1.3喹諾酮類抗生素在動物生長階段，將喹諾酮類抗生素全身給藥，可以導致關節和肌腱病。在犬發育階段，喹諾酮給藥可以造成關節軟骨中蛋白聚糖、軟骨細胞和細胞外基質的不可逆損失，表現為步態紊亂[13]。在幼年豚鼠，喹諾酮類抗生素全身給藥后，關節軟骨上層的退行性病變在第1天即被檢測到。但是，深層組織不容易受到影響[14]。動物實驗中較常用到的喹諾酮類抗生素為恩諾沙星。

關節腔內注射藥物主要是通過藥物對細胞外基質中蛋白多糖降解作用，破壞膠原纖維網架結構，使得軟骨細胞因失去細胞外基質保護而退變、凋亡，最終導致整個軟骨被破壞。木瓜蛋白酶和膠原酶均直接對膝關節的關節軟骨結構進行破壞，不同之處在于木瓜蛋白酶水解軟骨細胞外基質中蛋白多糖，而膠原酶水解細胞外基質中膠原蛋白。喹諾酮類抗生素是通過全身代謝變化的改變引起膝關節的退行性病變。KOA化學模型的復制操作簡單，復制模型的周期短，成功率高，模型病理改變程度與藥物濃度密切相關。相比于全身給藥方式，關節內注射方式更為方便有效，在KOA病理改變及治療的研究中應用較多。但使用關節腔內注射藥物方法進行模型復制時，要注意不同的藥物濃度會造成軟骨不同程度的損傷，應根據實驗需要選擇合適的藥物濃度。關節腔內注射藥物在操作過程中針頭易劃傷軟骨組織。此外，在實驗指標的分析中需要考慮到藥物的代謝規律及炎性因子含量與時間之間的變化關系。

2.2機械模型主要包括關節內手術、關節外手術以及關節固定法。主要是通過對膝關節的生理結構、血液循環或運動狀態進行干預的機制來誘導KOA。

2.2.1關節內手術關節內手術方法主要有Hulth法、前交叉韌帶切除術、切除半月板術、韌帶切斷加內側半月板切除術。其通過破壞關節穩定組織，引起關節壓力負荷傳遞不均衡的機制引起KOA。

(1)Hulth法由Hulth等[15]在1970年提出，切除膝關節內側半月板、前后交叉韌帶和內側副韌帶后，膝關節穩定結構遭到嚴重破壞，力學作用下誘使關節軟骨損害。Pfander等[16]用Hulth法誘導兔KOA模型來觀測低功率密度的激光對實驗軟骨損傷兔膝關節的影響。方銳等[17]用Hulth法構建兔KOA模型，模型復制6周即可見骨關節炎早期改變。湯曉晨等[18]用Hulth法對家兔膝關節進行手術，并于術后7 d驅趕家兔，8周后觀察到軟骨明顯變性。

(2)前交叉韌帶切除術切斷前交叉韌帶手術創傷小，操作相對簡單。Hung LJ等[19]將前交叉韌帶切斷建立起兔KOA模型。袁雪凌等[20]將新西蘭大白兔前交叉韌帶切除，手術4周后可觀察到軟骨退變，術后12周軟骨嚴重退變。劉建湘等[21]對大鼠行前交叉韌帶切除術，通過對軟骨進行病理觀察、評分，確定成功建立起大鼠KOA模型。

(3)切除半月板術半月板切除后通過破壞膝關節的正常運動力學軸線，使關節局部承受的壓力增大引起關節軟骨退變。李忠等[22]切除小型豬雙膝的外側半月板，術后12周觀察股骨外側髁關節軟骨變性。朱彤等[23]切除兔內側半月板，同時用骨鉆對股骨內側髁關節軟骨面進行破壞，這種模型復制方式將膝關節運動力學軸線改變與軟骨的直接破壞相結合，建立起兔KOA動物模型。

(4)韌帶切斷加內側半月板切除術謝靖等[24]切斷小鼠內側副韌帶，用微小針頭鉤出內側半月板并切除，成功建立了一種微創方式誘導小鼠發生骨關節炎的動物模型。王云峰等[25]用此方法對家兔進行手術，術后14周觀察到極晚期骨關節炎改變。馬文明等[26]切斷SD大鼠膝前交叉韌帶并切除內側半月板，術后10周對關節軟骨進行肉眼和光鏡下觀察，可見重度關節軟骨退變改變。

關節內手術法通過手術方法破壞關節穩定組織，引起關節壓力負荷傳遞不均衡，軟骨基質的正常結構將遭到破壞，軟骨細胞因失去保護作用而受損，進而引起關節軟骨損傷、退變。隨著關節活動的持續，會出現病程的進一步改變，可見軟骨下骨裸露，軟骨下骨質骨折、壞死，關節面及周圍的骨質增生等。關節內手術方法多樣，其中Hulth法為經典法，但其創傷大，手術感染發生率高。前交叉韌帶切除術、半月板切除及前交叉韌帶切除術加半月板切除術均是在Hulth法基礎上作出的變通與改良，相比于Hulth法，這些手術創傷較小，出血、炎癥及感染情況也有降低。關節內手術KOA模型誘導方法其力學機制與人類KOA相似，模型的可復性強，病理改變與時間相關，隨著時間的延長，病理改變逐步加重。但關節內手術操作較為復雜，在手術過程中存在出血、炎癥、感染等因素的影響，因此需要操作者清晰地了解膝關節組織結構，掌握熟練的操作手法，還要求實驗室具備較好的實驗條件。

2.2.2關節外手術關節外手術包括血管結扎和切除卵巢法。其通過影響下肢血液循環或激素代謝改變引發KOA。

(1)血管結扎黃肖華等[27]雙重結扎兔股靜脈，術后8周觀察可見兔膝關節軟骨早中期病理改變。賀文楠等[28]用結扎兔股靜脈結合切斷腓腸肌的方法將血管結扎與力學改變兩種因素的作用進行疊加，建立起兔KOA模型。術后12周觀察到晚期KOA改變。戴七一等[29]對兔下肢靜脈進行結扎，8周后可見關節軟骨明顯缺損及骨贅形成等早中期骨關節炎病理改變。

(2)卵巢切除絕經后婦女雌激素缺乏會增加KOA的風險[30]。因此，要研究KOA的這個潛在原因，需要復制卵巢切除致雌激素缺乏的KOA動物模型。成熟大鼠卵巢切除后骨關節炎動物模型已經被證明與人類絕經后骨關節炎的表現類似[31]。劉振峰等[32]采用卵巢切除法復制大鼠KOA模型。

下肢血管結扎法會造成靜脈回流受阻，骨內靜脈瘀滯會引起骨內高壓。骨內高壓的持續狀態使軟骨細胞分泌基質金屬蛋白酶-1和基質金屬蛋白酶-3增多，軟骨基質中膠原蛋白和蛋白多糖分解增加，軟骨損傷、退變；同時骨內高壓使軟骨下骨發生壞死，軟骨下骨硬度增加，因而軟骨下骨震蕩吸收能力下降，在力學作用下，進一步加重軟骨損傷[33]。血管結扎法作用于關節外，不產生關節內創傷及感染，但其更適合于探討與下肢血液循環障礙相關的KOA的研究。通過切除卵巢方式復制的KOA模型更適合于絕經后婦女KOA的相關研究。因此，關節外手術模型具有特定的適用的研究類型，應用的廣泛性較差。

2.2.3關節固定法關節固定法通過影響關節滑液的滲透作用的機制引起KOA。Haqiwara Y等[34-35]將大鼠的單側膝關節用螺釘和一個硬質塑料板剛性固定在150°的彎曲，來誘導KOA模型。Maldonado DC等[36]將Wistar大鼠膝關節固定在屈曲90°的位置，8周后發現關節軟骨退變。唐進等[37]用管型石膏將兔后膝關節伸直位固定6周后，觀察發現股骨內髁關節軟骨表面有早期退行性病變。

關節固定法通過對膝關節的制動，直接影響關節滑液的滲透作用，使得關節軟骨營養不足，且喪失了對滑膜炎癥的屏障作用，引起關節軟骨破壞。膝關節固定會造成膝關節周圍韌帶和肌肉的攣縮，致膝關節不穩定。此外固定還影響周圍血液循環形成骨內高壓，加劇軟骨損傷。關節固定法操作較為簡單，復制的KOA模型無手術創傷和關節內的影響，病理改變隨固定時間的延長呈進行性加重。但其誘導的KOA模型不穩定，且動物適應性差，模型成功率較低。此外，在固定期間不適合對KOA進行局部治療，影響對KOA進行的早期防治研究。

3結語

KOA動物模型的復制方法多種多樣，采用不同的動物和不同的方法所復制的KOA模型各有其不同的特點。通過對以上單一方式復制KOA動物模型誘發KOA機制的分析，可以發現，雖然以上模型誘發KOA的機制各不相同，但都會引起關節軟骨損傷繼發軟骨下骨改變。相比于自發性模型，實驗誘導性模型應用更為廣泛。但每種誘導方法在操作過程中均存在需要注意的地方。使用關節腔內注射藥物方法進行模型復制時，要反復練習，在操作中盡量避免注射針頭劃傷軟骨；使用關節內手術方法進行模型復制時，要求細心熟練操作并嚴格執行無菌操作，以減少出血、炎癥、感染等情況的出現；使用關節固定法進行模型復制時應對固定器具進行改良，以增強動物的舒適度，減少實驗動物的不適及反抗，提高模型復制的成功率。總之，復制一個相對理想的KOA動物模型，需要結合實驗需求進行動物的選擇、模型復制方法的選擇，并對模型復制方法進行反復操作，必要時可以根據實驗需要對模型復制方法進行改良。

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·綜述·

收稿日期：(2015-07-20；編輯：曹健)

通信作者：胡玲，hulingtcm@126.com

作者簡介：段文秀(1992-)，女，碩士研究生

基金項目：國家重點基礎研究發展計劃(2015CB554504)

[中圖分類號]R684.3[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2015.06.028