乙酰化修飾枸杞多糖及其抗氧化、抗腫瘤活性研究

彭天元，劉家水，顏紅專

(1.安徽醫科大學，安徽 合肥　230032；2.安慶醫藥高等專科學校，安徽 安慶　246052)

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乙酰化修飾枸杞多糖及其抗氧化、抗腫瘤活性研究

彭天元1，劉家水2，顏紅專2

(1.安徽醫科大學，安徽 合肥230032；2.安慶醫藥高等專科學校，安徽 安慶246052)

[摘要]目的觀察分子結構乙酰化修飾對枸杞多糖(Lycium barbarum L.polysaccharide，LBP)體內抗氧化、抗腫瘤活性的影響。方法通過分子結構乙酰化修飾得到枸杞多糖乙酰化衍生物LBPa；將昆明種小鼠隨機分成空白對照組，陽性對照組(維生素C)，LBP高、低劑量組及LBPa高、低劑量組，測定小鼠血清和肝臟丙二醛(malondialdehyde，MDA)、肝臟總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)和過氧化氫酶(catalase，CAT)。復制H22荷瘤小鼠模型，灌胃給藥LBP，考察LBPa和LBP對腫瘤細胞抑制率、脾臟指數、胸腺指數及血清腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和白介素-2(interleukin，IL-2)含量的影響。結果LBPa可以顯著提高正常小鼠肝組織CAT活力及T-AOC，降低小鼠血清及肝臟MDA含量，其抗氧化效果優于維生素C及LBP，LBPa及LBP抗氧化活性均與劑量具有正相關性。LBPa可顯著抑制H22腫瘤細胞增殖，提高免疫器官指數，提高血清IL-2及TNF-α含量；除IL-2含量外，對其他指標的影響均有劑量依賴性；LBPa抗腫瘤活性明顯優于LBP。結論乙酰化修飾可顯著提高LBP的抗氧化及抗腫瘤活性。

[關鍵詞]枸杞多糖；乙酰化修飾；抗氧化；抗腫瘤

枸杞多糖(LyciumbarbarumL.polysaccharide，LBP)，存在于茄科植物寧夏枸杞LyciumbarbarumL.干燥成熟果實中[1-2]。大量研究表明LBP具有抗腫瘤[3]、降血糖[4]、抗氧化[5]及抗潰瘍[6]等活性。

天然來源的多糖具有低毒、無不良反應的優勢，但也存在一些不足：①有些天然多糖并不具有生物學活性[7]；②有些多糖因為其理化性質或空間結構等問題，限制了其藥理活性；③一些多糖生物學活性較弱，還需要進一步改善[8]。目前國內外已有大量文獻報道關于分子修飾多糖從而獲得理想的活性多糖。分子修飾方法主要分為化學修飾、物理修飾及生物修飾，其中化學修飾運用最廣。化學修飾方法主要通過嫁接其他基團或者元素，以達到多糖改性的目的[9]。研究指出分子修飾后的多糖不僅可以提高原有的生物學活性，有些甚至可以產生新的藥理作用。例如天然茯苓多糖僅有良好的免疫調節作用，但經硫酸酯化后具有顯著的抗S180腫瘤活性[10]。纖維素因不溶于水，對其分子直接修飾難度較大，首先需乙酰化修飾以增加其溶解性，之后再進行硫酸酯化修飾，得到的乙酰化-硫酸酯化纖維素具有顯著的抗HIV活性[11]。然而對于LBP乙酰化修飾尚無研究報道，從其他關于多糖乙酰化的研究報道可以推測，乙酰化可使多糖改變定向性及橫向次序，從而改變多糖的空間排布，增加其水溶性，改善其活性。因此本研究采用乙酰化修飾LBP得到其乙酰化衍生物LBPa，通過體內抗氧化實驗檢測LBPa抗氧化及抗腫瘤活性，為LBP相關藥品及功能保健品的開發奠定理論基礎。

1材料與儀器

1.1試藥與試劑LBP：實驗室自制，經水提醇沉法[12]獲得粗多糖后采用Superdex-G 200分離得到純化LBP，Sevag法測得多糖純度為97.3%；過氧化氫酶(catalase，CAT)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒、總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒：南京建成生物工程研究所；三氯乙酸、吡啶、甲酰胺、乙酸酐、無水乙醇均為分析純。

1.2實驗動物SPF級KM小鼠及SD大鼠，中科院上海動物中心提供，動物生產許可證號為SCXK(滬)2003-0003，體質量分別為(20±2)g及(220±20)g。

1.3儀器DL-5000B離心機：上海飛鴿科學儀器廠；RE52-4旋轉蒸發儀：江蘇省常州金壇儀器有限公司；FA2004電子天平：上海菁華儀器有限公司；501型恒溫水浴鍋：上海實驗儀器廠有限公司；UV-360紫外可見分光光度計：日本島津公司。

2方法

2.1LBP乙酰化衍生物制備按文獻[13]方法，稱取400 mg LBP溶于10 mL蒸餾水中，充分溶解，用NaOH調節溶液pH值至9.0，然后緩慢滴加5 mL甲酰胺，同時滴加NaOH溶液以維持反應體系的pH值在8.0～8.4之間，反應過程中持續攪拌，反應結束后滴加鹽酸至溶液呈中性，乙醇沉淀反應體系，沉淀物用95%乙醇洗滌，冷凍干燥后溶于100 mL去蒸餾水中，3 000 Da透析袋透析72 h，濃縮，醇沉，冷凍干燥即得LBP乙酰化衍生物LBPa。采用IR檢測乙酰化成功與否[13]。

2.2LBPa對正常小鼠抗氧化能力的影響將60只KM小鼠隨機分成6組，雌雄各半。分別為空白對照組(每天灌胃0.9%生理鹽水)、陽性對照組(維生素C 500 mg/kg，用前新鮮配制)、LBP低劑量組(100 mg/kg)、LBP高劑量組(300 mg/kg)、LBPa低劑量組(100 mg/kg)和LBPa高劑量組(300 mg/kg)。連續灌胃給藥15 d，末次給藥后眼眶取血，收集后離心取血清。麻醉處死小鼠，剖取肝臟，按試劑盒指導方法檢測小鼠血清和肝臟MDA、肝臟T-AOC和肝臟CAT。

2.3LBPa體內抑制H22腫瘤細胞增殖作用從H22荷瘤小鼠腹腔中抽取瘤液，生理鹽水調節細胞密度至1×106/mL，臺酚藍染色，鏡檢，細胞存活率不小于95%。取無菌潔凈級BALB/c雄性小鼠(20±2)g，右腹股溝皮下植入0.1 mL瘤細胞懸液。接種后，小鼠自由飲食。24 h后，將小鼠隨機分為模型組(0.9% NaCl)，陽性對照組(環磷酰胺，30 mg/kg)，LBP及LBPa高、低劑量組(分別為300、100 mg/kg)，每組各10只。每天灌胃給藥1次相應藥物，10 d后稱質量，處死小鼠，各組小鼠眼眶靜脈叢取血，離心，分離血清，按試劑盒說明書指導操作，計算血清腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和白介素-2(interleukin，IL-2)含量。同時稱量腫瘤、脾臟及胸腺質量。計算腫瘤抑制率、脾臟指數及胸腺指數。

式中Wc為對照組平均腫瘤質量，Wt為實驗組平均腫瘤質量。

3結果

3.2LBPa對正常小鼠抗氧化能力的影響MDA是細胞導致脂質過氧化的代謝產物，因此MDA濃度越低，則脂質過氧化程度越低，表明機體抗氧化能力就越強[14]。CAT可促使體內積聚的H2O2分解為氧和水，從而使細胞免于H2O2的氧化損傷[15]。

空白對照組，陽性對照組，LBPa高、低劑量組血清MDA、肝臟MDA、肝臟T-AOC和肝臟CAT活力比較，差異均具有統計學意義(血清MDA：F(3，36)=72.80，P=0.000；肝臟MDA：F(3，36)=151.07，P=0.000；肝臟T-AOC：F(3，36)=89.94，P=0.000；肝臟CAT：F(3，36)=103.76，P=0.000)，LBPa高、低劑量組血清和肝臟MDA水平顯著低于陽性對照組和空白對照組(P<0.05)，而肝臟T-AOC和肝臟CAT活力顯著高于陽性對照組和空白對照組(P<0.05)。結果說明LBPa在提高正常小鼠抗氧化能力方面明顯優于陽性對照藥維生素C。見表1。

表1　LBPa對正常小鼠抗氧化能力的影響±s)

注：同列具有不同右上標符號的組別比較，P<0.05。

3.3乙酰化修飾因素和劑量因素對正常小鼠抗氧化能力的影響兩因素方差分析結果顯示，乙酰化修飾因素和劑量因素對血清MDA、肝臟MDA、肝臟T-AOC和肝臟CAT活力的主效應均具有統計學意義(P<0.05)，兩者的交互作用均無統計學意義(P>0.05)，見表2。簡單效應分析結果顯示，對于同一劑量，LBPa降低血清和肝臟MDA及升高肝臟T-AOC和CAT活力的效應優于LBP；對于LBP或LBPa，高劑量的效應均優于低劑量。結果提示，在提高正常小鼠抗氧化能力方面，乙酰化修飾的LBP的效應優于未修飾的效應，高劑量的效應優于低劑量的效應。見表3。

表2　乙酰化修飾因素和劑量因素對正常小鼠抗氧化能力影響的兩因素方差分析結果

3.4LBPa對H22腫瘤細胞增殖活性及其對血清TNF-α及IL-2含量的影響LBPa高、低劑量組腫瘤抑制率均低于陽性對照組，脾臟指數和胸腺指數均高于陽性對照組(P<0.05)，LBPa高、低劑量組之間脾臟指數和胸腺指數比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。結果提示環磷酰胺雖然抗腫瘤活性較強，但對免疫器官具有顯著的抑制作用。LBPa高、低劑量組和陽性對照組血清TNF-α和IL-2水平較模型組顯著升高(P<0.05)，且LBPa高、低劑量組血清IL-2水平顯著低于陽性對照組(P<0.05)。見表4。

表3　不同劑量LBP和LBPa對正常小鼠抗氧化能力的影響±s)

注：與LBP低劑量組比較，*P<0.05；與LBPa低劑量組比較，#P<0.05；與LBP高劑量組比較，△P<0.05。

表4　LBPa對H22荷瘤小鼠腫瘤抑制率、脾臟指數、胸腺指數及血清TNF-α、IL-2水平的影響±s)

注：同列具有相同右上標符號的組別比較，P>0.05；同列具有不同右上標符號的組別比較，P<0.05。

3.5乙酰化修飾因素和劑量因素對H22腫瘤細胞增殖活性及其對血清TNF-α及IL-2含量的影響兩因素方差分析結果顯示，乙酰化修飾因素和劑量因素對脾臟指數、胸腺指數和血清TNF-α的主效應均具有統計學意義(P<0.05)，乙酰化修飾因素對血清IL-2的主效應具有統計學意義(P<0.05)，兩者的交互作用均無統計學意義(P>0.05)，見表5。簡單效應分析結果顯示，相同劑量的LBPa對腫瘤的抑制作用高于相同劑量的LBP，血清TNF-α水平明顯高于相同劑量的LBP(P<0.05)，而對脾臟和胸腺的抑制作用均明顯低于相同劑量的LBP(P<0.05)，見表6。結果提示，乙酰化修飾的LBP抑制腫瘤的效應及升高血清TNF-α和IL-2的效應明顯優于未修飾的LBP，其抑制免疫器官的效應明顯低于未修飾的LBP，在保護脾臟和胸腺，升高血清TNF-α方面具有明顯的劑量依賴性，在升高血清IL-2方面無明顯的量效關系。

4討論

機體絕大部分病變與體內抗氧化能力衰退有關，當機體不能及時清理體內過氧化物時，則會導致細胞損傷，進而導致機體受損、病變。本研究結果表明，LBP及LBPa均能提高機體抗氧化活力，且經乙酰化修飾的LBPa抗氧化活性優于未經修飾的天然的LBP，表明乙酰化修飾可以提高LBP的抗氧化活性。此外胸腺通過產生T淋巴細胞以及胸腺素發揮免疫作用，脾臟與體液免疫關系密切，因此LBPa及LBP抗腫瘤活性機制之一可能為其能夠提升機體免疫器官作用從而發揮抗腫瘤活性；另外，LBP及LBPa可使H22荷瘤小鼠血清IL-2及TNF-α的含量增加，TNF-α可直接殺傷腫瘤細胞而對正常細胞無明顯毒性，而IL-2通過調節機體的免疫系統發揮抗癌活性[16]，且LBPa活性更優。

表6　不同劑量LBP和LBPa對H22腫瘤細胞增殖活性及其對血清TNF-α及IL-2含量的影響±s)

注：與LBP低劑量組比較，*P<0.05；與LBPa低劑量組比較，#P<0.05；與LBP高劑量組比較，△P<0.05。

以上結果表明，LBP乙酰化衍生物的抗氧化及抗腫瘤活性均顯著優于未經修飾的天然LBP。其原因可能是乙酰化修飾改變LBP的定向性及橫向次序，因而改變其空間排布，增加其親水性，有利于藥物吸收，從而提高了LBP活性。

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Acetylation ofLyciumbarbarumL. Polysaccharide and Its Antioxidant and Antitumor Activities

PENGTian-yuan1,LIUJia-shui2,YANHong-zhuan2

(1.AnhuiMedicalUniversity,AnhuiHefei230032,China; 2.AnqingMedicalandPharmaceuticalCollege,AnhuiAnqing246052,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the influence of acetylation on the in vivo antioxidant and antitumor activities of Lycium barbarum L. polysaccharide (LBP). MethodsLBPa, the acetyl derivative of LBP, was obtained through acetylation. Kunming mice were randomly divided into blank control group, positive control group (vitamin C), low- and high-dose LBP groups, and low- and high-dose LBPa groups, and serum and liver malondialdehyde (MDA), total antioxidant capacity (T-AOC) of the liver, and catalase (CAT) were determined. A H22 tumor-bearing mouse model was established, and these mice were given LBP by gavage. The influence of LBPa and LBP on the inhibition rate of tumor cells, spleen index, thymus index, and serum levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-2 (IL-2) was observed. ResultsLBPa significantly improved liver CAT activity and T-AOC in normal mice and reduced the content of serum and liver MDA, achieving a better antioxidant effect than vitamin C and LBP; the antioxidant activity of LBP and LBPa was positively correlated with their doses. LBPa significantly inhibited the proliferation of H22 tumor cells, improved the immune organ index, and increased the serum levels of IL-2 and TNF-α; the influence on all indices except IL-2 was dose-dependent; LBPa had a better antitumor activity than LBP. ConclusionAcetylation can significantly improve the antioxidant and antitumor activities of LBP.

[Key words]Ganoderma lucidum L. polysaccharide; acetylation; antioxidant; antitumor

收稿日期：(2015-07-20；編輯：姚實林)

通信作者：顏紅專，yan1hz@163.com

作者簡介：彭天元(1990-)，男，碩士研究生

基金項目：高等學校博士學科點專項科研基金(20113420120001)

[中圖分類號]R285.5[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2015.06.020