不同濃度乙醇對TNBS誘導小鼠克羅恩病模型的影響

劉智娟，宋莎莎，王佳佳，方海明，章禮久

技術與方法

不同濃度乙醇對TNBS誘導小鼠克羅恩病模型的影響

劉智娟1，宋莎莎1，王佳佳2，方海明1，章禮久

建立2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）小鼠克羅恩病（CD）模型，通過觀察小鼠每日表現、存活率、疾病活動指數（DAI）、結腸肉眼觀和組織學變化及腸道纖維化情況，篩選出造模所需最佳乙醇濃度。各模型組小鼠均不同程度出現CD的一般表現。隨著乙醇濃度增加，小鼠DAI評分、腸道病理及纖維化評分逐漸增高，以TNBS／50%乙醇組最為顯著，最類似人類CD病理改變。50%為造模所需最佳乙醇濃度，其配比2.0 mg TNBS誘導的模型成模率高且小鼠生存率適中，較適宜用作CD發病機制研究和新靶點的探索。

乙醇；2，4，6-三硝基苯磺酸；小鼠；克羅恩病；腸纖維化

克羅恩病（Crohn’s disease，CD）是一種主要由免疫反應失調引起的胃腸道慢性肉芽腫性炎癥性疾病。目前在我國，其發病率呈逐年升高趨勢［1］。腸道的慢性炎癥及損傷可導致腸纖維化乃至腸梗阻等嚴重并發癥的發生。因此，對CD腸纖維化發病機制的研究成為熱門方向。目前誘導慢性結腸炎動物模型最常用2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS）和乙醇混合液［2］。盡管TNBS／乙醇誘導的慢性結腸炎模型已被廣泛應用，但各文獻所報道的TNBS劑量及乙醇濃度不盡相同。目前關于TNBS劑量對造模影響方面的研究較多。鑒于此，該研究擬定2.0 mg TNBS作為灌腸液，同時設定20%、40%、50%3個乙醇濃度組，著重探討不同濃度乙醇對實驗小鼠造模的影響，以篩選出造模所需最佳乙醇濃度，建立符合實驗要求的動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物48只SPF級BALB／c小鼠，雌性，18～22 g，購于安徽醫科大學實驗動物中心。

1.2 藥物與試劑TNBS（美國Sigma公司），批號：p2297；無水乙醇（合肥吉之暢公司），批號：2C1312302。

1.3 儀器 BM-Ⅱ型病理組織包埋機（安徽電子科學研究所）；石蠟切片機（德國Leica公司）；ECLIPSE 80i光學顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.4 動物模型的制備及取材BALB／c小鼠隨機分為正常組、TNBS／20%乙醇組、TNBS／40%乙醇組、TNBS／50%乙醇組，每組12只。小鼠禁食、不禁飲24 h后，3%水合氯醛腹腔注射輕度麻醉。模型組小鼠使用3.5 F導管自肛門插入腸道深約3.5 cm處，頭朝下呈倒立位，將各組造模用灌腸液緩慢注入結腸，停留30 s后輕輕拔出導管，小鼠再倒懸60 s左右，期間堵住小鼠肛門口，防止藥液流出，后放回籠中，待其自然蘇醒。正常組以同體積生理鹽水灌腸。灌腸6周，后正常飼養。所有小鼠于第7周處死。分離結腸，沿腸系膜緣剪開腸腔，生理鹽水沖洗糞便，取距肛門3 cm以上及結腸病變最明顯部分，經10%甲醛保存。

1.5 疾病模型的評價

1.5.1 一般指標 觀察小鼠的大便性狀、精神狀態、進食飲水、一般活動及死亡情況。

1.5.2 小鼠疾病活動指數（disease activity index，DAI）評估 每日觀察小鼠體重變化及大便性狀，化驗大便常規及進行大便潛血實驗。根據Ganta et al［3］制定的標準進行DAI評估，由體重減失率分數和大便隱血程度分數相加而得，分值在0～8，體重減失率（%）＝（實驗前體重－造模后體重）／實驗前體重×100%。見表1。

1.5.3 結腸肉眼觀和病理組織學評分 先肉眼觀察結腸黏膜變化。結腸標本經10%甲醛固定后，由石蠟包埋切片，行HE染色，并根據Videla et al［4］制定的標準進行病理組織學評分。

1.5.4 VG染色觀察小鼠腸道纖維化情況 根據Lawrance et al［5］制定的半定量標準來判斷，0：無明顯膠原纖維增生、無明顯固有肌層增厚；1：膠原纖維稍增多、固有肌層稍增厚；2：膠原纖維明顯增多、固有肌層明顯增厚；3：膠原纖維明顯增多、組織結構明顯改變、固有肌層明顯增厚。

1.6 統計學處理應用SPSS 13.0統計軟件包進行分析，數據以±s表示。組間比較采用Student’s t檢驗。

2 結果

2.1 小鼠一般情況正常組小鼠精神佳，進食飲水量正常，排黃色成形軟便。TNBS／20%、40%乙醇組小鼠灌腸24 h后精神狀態一般，食欲下降，部分出現解稀水樣黏液血便，第2、3天最明顯，此后有所緩解，但第3～4周上述癥狀又有所加重。TNBS／50%乙醇組小鼠造模24 h后出現精神差、懶動、厭食、消瘦、扎堆、蜷縮，部分小鼠排黏液膿血便。各組小鼠生存率分別為91.7%、83.3%、83.3%、75.0%。

2.2 小鼠DAI評分正常組小鼠自灌腸第3天出現體重輕度下降，1周后開始恢復，后期基本維持平穩，排黃色軟便，大便潛血（－）。TNBS／20%、40%乙醇組小鼠造模后體重明顯下降，后期逐漸穩定，間斷解黃褐色稀水樣便，大便潛血實驗（－～++）。TNBS／50%乙醇組小鼠自灌腸后第1天起出現體重下降，第3周達到頂峰，隨后的4～6周，存活小鼠體重稍有波動，逐漸恢復造模前體重，部分小鼠解黏液膿血便，肛周可見血痂附著，大便潛血實驗（＋～+++）。DAI評分結果顯示，與正常組比較，各模型組小鼠各時間點DAI評分均顯著增高，且隨著乙醇濃度增加，DAI評分逐漸增加，以TNBS／50%乙醇組最高（P＜0.01）。見圖1。

2.3 小鼠結腸大體形態正常組小鼠結腸形態正常、黏膜光滑；TNBS／20%、40%乙醇組小鼠結腸稍扭曲、連續性水腫；TNBS／50%乙醇組小鼠結腸某些節段發紅、扭曲、變形、僵硬，部分腸段可見狹窄，腸腔內有多量膿性粘液生成。見圖2。

2.4 小鼠腸道病理特征及評分正常組小鼠結腸黏膜上皮完整、結構清晰；TNBS／20%、40%乙醇組腸黏膜彌漫性充血紅腫，黏膜下層有少量淋巴細胞浸潤，固有層中性粒細胞浸潤，部分腸上皮細胞脫落壞死，肌層增厚；TNBS／50%乙醇組結腸黏膜彌漫性充血、出血，杯狀細胞消失，固有層中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，黏膜層至肌層可見非局限性透壁性壞死，黏膜上皮糜爛、潰瘍，部分腸上皮細胞再生，肌層增厚。見圖3。病理評分結果顯示，與正常組比較，各模型組病理學評分均顯著增加，且隨著乙醇濃度的增加而增加（P＜0.01，P＜0.05）。見表2。

表2 病理學評分（分，±s）

與正常組比較：**P＜0.01，*P＜0.05；與TNBS／20%乙醇組比較：＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與TNBS／40%乙醇組比較：▲▲P＜0.01

組別n 病理評分正常110.36±0.505 TNBS／20%乙醇101.40±0.516*TNBS／40%乙醇102.00±0.670**＃TNBS／50%乙醇93.22±0.667**＃＃▲▲

2.5 小鼠腸道纖維化情況正常組小鼠腸黏膜未見明顯膠原蛋白沉積；TNBS／20%乙醇組腸黏膜下層少量膠原蛋白，固有基層正常厚度；TNBS／40%乙醇組腸黏膜下層膠原蛋白沉積，固有基層稍增厚；TNBS／50%乙醇組小鼠近端結腸黏膜下層及漿膜層大量膠原蛋白沉淀，固有基層明顯增厚，偶可見纖維分隔形成，見圖4。

纖維化評分結果顯示，與正常組比較，各模型組纖維化評分均顯著增加（P＜0.01）。且與TNBS／20%乙醇組比較，TNBS／50%乙醇組纖維化評分顯著增加（P＜0.01）。見表3。

表3 腸道纖維化評分（分，±s）

與正常組比較：**P＜0.01；與TNBS／20%乙醇組比較：＃＃P＜0.01

組別n 纖維化評分正常110.09±0.30 TNBS／20%乙醇101.30±0.48**TNBS／40%乙醇101.80±0.79**TNBS／50%乙醇92.33±0.71**＃＃

3 討論

CD的許多研究成果來源于CD動物模型研究，因而構建合適的CD動物模型對CD的進一步研究非常重要。目前建立CD動物模型常用的方法有4種：化學誘導法、免疫誘導法、基因誘導法、自發性模型。本研究中，探討的是免疫誘導法，即使用TNBS／乙醇混合液灌腸誘導腸道免疫炎癥反應。目前普遍認為，TNBS／乙醇誘導小鼠CD的發病機制是乙醇作為有機溶劑破壞腸黏膜屏障后，TNBS作為一種半抗原物質，與結腸組織中大分子組織蛋白結合后成為一種抗原物質，引起機體免疫反應而誘導腸道炎癥的發生。

TNBS誘導的結腸炎模型最早是由Morris et al［6］采用大鼠制備。但通過文獻調研發現各學者相關研究往往在實驗動物的品系、周齡、基因遺傳背景、TNBS給藥劑量等方面均有所不同，這將為進一步深入研究慢性結腸炎帶來不便。研究［7］表明，BALB／c小鼠是對TNBS最為敏感的品系，2 mg為TNBS最常采用的造模劑量。te Velde et al［8］在實驗研究中采用35%、45%和50%濃度乙醇與TNBS配成灌腸液誘導6周齡SJL／J小鼠慢性結腸模型。Terai et al［9］用TNBS溶于40%乙醇作為灌腸劑誘導C57BL／6J小鼠結腸炎模型。基于此報道，此次實驗設定20%、40%、50%3個乙醇濃度組配比2.0 mg TNBS制成混合灌腸液，構建BALB／c小鼠CD腸纖維化模型，結合小鼠死亡率、DAI評分及病理改變、纖維化程度等綜合評估，篩選出造模所需最佳乙醇濃度。結果表明，TNBS／20%、40%乙醇組小鼠鏡下觀察雖有部分CD病理改變，但VG染色提示其黏膜下層少量膠原蛋白沉淀，未見明顯纖維分隔形成，未能成功制備出模型；TNBS／50%乙醇組小鼠雖較前兩組死亡率（25%）略高，但結合其一般表現和DAI評分；結腸大體形態特征—結腸扭曲、變形、僵硬，部分腸段可見狹窄，腸腔內有多量膿性黏液生成；腸道病理改變—黏膜充血，固有層大量淋巴細胞浸潤，黏膜上皮糜爛、線性潰瘍形成；腸纖維化情況—大量膠原蛋白沉淀，明顯纖維分隔形成，提示TNBS／50%乙醇組小鼠最接近人類CD腸纖維化臨床病理表現。

［1］ Latella G，Sferra R，Vetuschi A，et al.Prevention of colonic fi

brosis by Boswellia and Scutellaria extracts in rats with colitis induced by 2，4，5-trinitrobenzene sulphonic acid［J］.Eur J Clin Invest，2008，38（6）：410－20.

［2］ Martínez-Moya P，Romero-Calvo I，Requena P，et al.Dose-dependent antiinflammatory effect of ursodeoxycholic acid in experimental colitis［J］.Int Immunopharmacol，2013，15（2）：372－80.

［3］ Ganta V C，Cromer W，Mills G L，et al.Angiopoietin-2 in experimental colitis［J］.Inflamm Bowel Dis，2010，16（6）：1029－39.

［4］ Videla S，Vilaseca J，Medina C，et al.Selective inhibition of phosphodiesterase-4 ameliorates chronic colitis and prevents intestinal fibrosis［J］.J Pharmacol Exp Ther，2008，316（2）：940－5.

［5］ Lawrance I C，Wu F，Leite A Z，et al.A murine model of chronic inflammation induced intestinal fibrosis down-regulated by antisense NF-kappa B［J］.Gastroenterology，2003，125（6）：1750－61.

［6］ Morris G P，Beck P L，Herridge M S，et al.Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon［J］. Gastroenterology，1989，96（3）：795－803.

［7］ Krener B，Mariman R，van Erk M，et al.Temporal colonic gene expression profiling in the recurrent colitis model identifies early and chronic inflammatory processes［J］.PloS One，2012，7（11）：e50388.

［8］ te Velde A A，Verstege M I，Hommes D W.Critical appraisal of the current practice in murine TNBS-induced colitis［J］.Inflamm Bowel Dis，2006，12（10）：995－9.

［9］ Terai T，Osawa S，Tani S，et al.Induction of murine TNBS colitis is strictly controlled by a modified method using continuous inhalation anesthesia with sevoflurane［J］.Dig Dis Sci，2014，59（7）：1415－27.

The effect of different concentrations of ethanol on
mice Crohn’s disease model induced by TNBS

Liu Zhijuan1，Song Shasha1，Wang Jiajia2，et al
（1Dept of Gastroenterology，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601；2Dept of Pharmacology，Anhui Medical University，Hefei 230032）

Crohn’s disease（CD）mice model was induced by 2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid（TNBS）.The daily performance，survival rate，disease activity index（DAI），colon morphologic and histologic changes and intestinal fibrosis degree of mice were observed in order to investigate the optimal ethanol concentration.Mice in model groups all performed general symptoms of CD in different degrees.The grades of mice DAI，histology and intestinal fibrosis increased gradually with the increase of ethanol concentrations，and the TNBS／50%ethanol group was most significant which was most similar to human CD pathological changes.An ethanol concentration of 50%for mice was chosen for an optimal experimental concentration since the group had the highest success rate of modeling when matched with 2.0 mg TNBS and showed appropriate survival rate，which was more suitable for the investigation of pathogenesis and new therapeutic targets of CD.

ethanol；2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid；mice；Crohn’s disease；intestinal fibrosis

R 574.622

1000－1492（2015）01－0112－04

2014－09－25接收

安徽省自然科學基金項目（編號：1408085MH178）；安徽省教育廳自然科學基金項目（編號：KJ2011Z191）

1安徽醫科大學第二附屬醫院消化內科，合肥 2306012安徽醫科大學藥理學教研室，合肥 230032

劉智娟，女，碩士研究生；方海明，男，博士，副教授，責任作者，E-mail：haimingfang＠163.com；章禮久，男，主任醫師，副教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：zhanglijiu6336＠163.com