飼用淀粉酶產(chǎn)生菌株的篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

賈國賓 ， 李卓偉 ， 楊國輝 *， 魏麗娟 ， 張 沛 ， 王德功 ， 劉 冬

（1.河北遠征藥業(yè)有限公司，河北石家莊 050041；2.河北省獸藥工程技術研究中心，河北石家莊050041）

淀粉酶是能夠催化淀粉使其水解為葡萄糖、麥芽糖、低聚糖類的一類酶的總稱。目前工業(yè)生產(chǎn)應用所需的淀粉酶以微生物為主要來源，尤其是以芽孢桿菌所產(chǎn)的淀粉酶較多 （謝鳳行等，2009；張雙民，2006）。產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌具有易貯存、耐高溫高壓、抗逆性強等獨特的生物學特性 （辛娜等，2011）。本試驗以雞、豬、牛的小腸黏膜為菌源進行耐膽鹽產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選，并對其產(chǎn)酶發(fā)酵條件進行優(yōu)化，以為工業(yè)生產(chǎn)淀粉酶提供菌株。

1 試驗材料

1.1 菌源 健康青年雞、豬、牛空腸黏膜。

1.2 培養(yǎng)基及試劑 NB培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，NaCl 0.5%，pH值7.2～7.4。

0.3%膽酸鹽NB瓊脂培養(yǎng)基：NB培養(yǎng)基+瓊脂2%+0.3%膽酸鹽，pH值7.0。

NA培養(yǎng)基：NB培養(yǎng)基+瓊脂1.5%～2%，pH值7.2～7.4。

淀粉培養(yǎng)基：可溶性淀粉0.2%，蛋白胨1%，牛肉膏 0.5%，MgSO4·7H2O 0.1%，Na2HPO45%，瓊脂1.5% ～2%，NaCl 5%，pH值7.0～7.2。

淀粉酶基礎發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨20.0 g，牛肉浸粉 20.0 g，Na2HPO45.0 g，NaCl 0.1 g，水 1000 mL，pH值7.0～7.4。

生理生化鑒定所用培養(yǎng)基參照 《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》（東秀珠和蔡妙英，2001）。

NaCl、NaOH、HCl、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·2H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、CaC12、ZnCl2、Cu-Cl2、FeCl2、MnCl2均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

2 試驗方法

2.1 膽酸鹽耐受性菌株的分離 無菌條件下剪下屠宰后青年雞、豬、牛空腸各一小段，分別擠出腸道內(nèi)容物后縱向剖開，刮取空腸黏膜黏液，涂抹在無菌載玻片上并盛于無菌燒杯內(nèi)，37℃風干48 h。

烘干后將載玻片上樣品放入無菌三角瓶中，并加入無菌生理鹽水，利用漩渦振蕩器充分振搖，80℃水浴加熱15 min后，進行梯度稀釋。

取1.0 mL樣品進行梯度稀釋，分別取適宜稀釋度的樣品液0.1 mL加入到凝固的0.3%膽酸鹽LB瓊脂培養(yǎng)基平板內(nèi)，涂布器均勻涂布后，于37℃生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24～48 h，從中挑取出具有不同菌落形態(tài)的單菌落轉接到NA培養(yǎng)基試管斜面上，培養(yǎng)48 h后，4℃保存，備用。

2.2 產(chǎn)酶菌株的初篩 將得到的已保存菌株點種于淀粉培養(yǎng)基平板上，37℃進行培養(yǎng)，24 h后從平皿中選取生長的菌落轉接至NA培養(yǎng)基試管斜面，并點種在淀粉培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，時間為48 h。

在培養(yǎng)后的淀粉平板上滴加盧戈氏碘液。記錄水解圈直徑與菌落直徑比值 （H/C值），H/C值較大的菌株即為所需菌株。

2.3 產(chǎn)酶菌株的復篩 將以上所得初篩各菌株接種于裝有50 mL NB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，培養(yǎng)溫度37℃、搖床轉速180 r/min培養(yǎng)16 h，制成種子液。

將種子液按體積分數(shù)6%的接種量接種于裝有50 mL淀粉酶發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中37℃培養(yǎng)36 h，搖床轉速180 r/min。將發(fā)酵液在4℃條件下以10000 r/min離心10 min，取上清液制粗酶液。

采用Yoo等（1987）改良法計算酶活力，以在55℃，5 min內(nèi)水解1 mg（0.5%）淀粉定義為一個酶活力單位。以此為復篩標準，從中選取產(chǎn)酶活性較高的菌株3～4株。

2.4 產(chǎn)酶發(fā)酵條件優(yōu)化 改變基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源、氮源、無機鹽、緩沖對等成分配制發(fā)酵培養(yǎng)基，121℃滅菌15 min，250 mL三角瓶裝量50 mL，以6%的接種量接種發(fā)酵15 h種子液，37℃、180 r/min發(fā)酵培養(yǎng)36 h。并在以測定粗酶液酶活性為主要參考指標的同時測定發(fā)酵液吸光度值即菌液OD值進行含菌量測定，以確定菌株的最佳碳、氮源，無機鹽及緩沖液的成分，并通過正交試驗確定各成分最佳百分比。

3 結果與分析

3.1 芽孢桿菌的分離 在含0.3%膽酸鹽LA平板上通過對腸道壁刮取物的培養(yǎng)，共分離出205株耐膽酸鹽的芽孢桿菌。其中在淀粉平板上出現(xiàn)水解圈的有56株菌，挑選產(chǎn)淀粉酶活力較高的YZ-ZH03、YZ-ZK22、YZ-JH41、YZ-JH43 和 YZNH65五株芽孢桿菌測定搖瓶條件產(chǎn)酶能力，進行復篩。

3.2 淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選 由表1可以看出，在淀粉平板上的點種的5株菌中YZ-ZH03的Hc值高于其他4株菌，而經(jīng)過粗酶液的酶活力測定，該菌株的酶活力均高于其他菌株，為最優(yōu)菌株，即選擇YZ-ZH03菌株作為進一步研究的對象。

表1 產(chǎn)淀粉酶菌株在淀粉平板的水解淀粉特性和發(fā)酵液淀粉酶活性

3.3 產(chǎn)酶條件優(yōu)化

3.3.1 不同碳源對YZ-ZH03菌株發(fā)酵液菌體濃度和酶活力的影響 分別以等量淀粉、玉米粉、蔗糖、乳糖、葡萄糖、糊精、麩皮替代基礎培養(yǎng)基中的牛肉浸粉，在其他成分不變的情況下，按裝液量50mL/250mL三角瓶，接種量為2%，37℃、180r/min搖瓶發(fā)酵24 h后測定發(fā)酵液菌體濃度并計算酶活力大小（圖1）。

圖1 不同碳源對YZ-ZH03菌株發(fā)酵液菌體濃度和酶活力的影響

試驗結果表明YZ-ZH03菌株以葡萄糖作為碳源時發(fā)酵液酶活力大小為94.21 U/mL，與初始培養(yǎng)基發(fā)酵液酶活力相比提高了2.80%（P＜0.05），發(fā)酵液OD600值為0.587；糊精作為碳源時發(fā)酵液酶活力大小為92.52 U/mL，與初始培養(yǎng)基發(fā)酵酶活力相比提高了1.00%（P＜0.05），發(fā)酵液OD600值為0.572，而其他碳源的選擇對酶活力的影響不顯著，尤其個別碳源的代替降低了發(fā)酵液的酶活力。最終選擇葡萄糖為其最優(yōu)碳源。3.3.2 不同氮源對YZ-ZH03菌株發(fā)酵液菌體濃度及酶活力的影響 選用上述優(yōu)化后的最佳碳源，分別以等量大豆蛋白胨、胰蛋白胨、玉米漿、黃豆餅粉、酵母膏、尿素、硫酸銨作為氮源替代基礎培養(yǎng)基中的蛋白胨，在其他成分及培養(yǎng)條件不變的情況下測定發(fā)酵24 h后各指標值，結果如圖2所示。

圖2 不同氮源對YZ-ZH03菌株發(fā)酵液菌體濃度及酶活力的影響

試驗結果表明，YZ-ZH03菌株以尿素為氮源時發(fā)酵液酶活力為96.60 U/mL，發(fā)酵液OD600值為0.604；黃豆餅粉作為氮源時發(fā)酵液酶活力大小為94.43 U/mL，發(fā)酵液OD600值為0.661，而其他氮源的選擇對酶活力的增加效果不明顯。統(tǒng)計分析結果表明，尿素作為氮源酶活力提高了5.50%（P＜0.05），對發(fā)酵結果影響顯著，而其他氮源的替換使發(fā)酵效果降低。最終選擇尿素為最優(yōu)氮源。

3.3.3 不同無機鹽對YZ-ZH03菌株發(fā)酵液菌體濃度及酶活力的影響 選用上述優(yōu)化后的最佳碳源和氮源， 分別添加0.2%的 CaCO3、CuSO4、Zn-SO4、MnSO4·H2O、MgSO4·7H2O 替代基礎培養(yǎng)基中NaCl，在其他成分及培養(yǎng)條件不變的情況下測定發(fā)酵24 h后各指標值，結果如圖3所示。

圖3 不同無機鹽對YZ-ZH03菌株發(fā)酵液菌體濃度及酶活力的影響

試驗結果表明YZ-ZH03菌株以其他無機鹽進行試驗，發(fā)酵液酶活力均小于初始培養(yǎng)基中所使用的NaCl。最終選擇Nacl為最佳無機鹽成分。

3.3.4 不同配比緩沖液對YZ-ZH03菌株發(fā)酵液菌體濃度及酶活力的影響 選用K2HPO4和KH2PO4緩沖對按 0、1∶0.1、0.2∶0.1、0.3∶0.1、0.4∶0.1的比例加入至基礎培養(yǎng)基中。測定發(fā)酵24 h后各指標值，結果見圖4。

圖4 不同配比緩沖液對YZ-ZH03菌株發(fā)酵液菌體濃度及酶活力的影響

試驗結果表明，YZ-ZH03菌株以0.4∶0.1作為緩沖液配比的發(fā)酵液酶活力大小為101.27 U/mL，發(fā)酵液OD600值為0.632，而其他配比的選擇對酶活力的增加幾乎沒有影響。統(tǒng)計分析結果表明，以0.4∶0.1作為緩沖液配比使酶活力提高了10.56%（P＜0.05），對發(fā)酵結果影響顯著。根據(jù)最終分析選擇緩沖對最佳配比為0.4∶0.1。

3.3.5 發(fā)酵時間對YZ-ZH03菌株發(fā)酵液菌體濃度及酶活力的影響 選用所選最佳發(fā)酵培養(yǎng)成分，按裝液量50 mL/250 mL三角瓶，接種量為2%，37℃、180 r/min培養(yǎng)，測定搖瓶發(fā)酵 18、24、30、36 h后發(fā)酵液菌體濃度及酶活力，結果見圖5。

圖5 發(fā)酵時間對YZ-ZH03菌株發(fā)酵液菌體濃度及酶活力的影響

試驗結果表明，YZ-ZH03菌株在發(fā)酵過程中隨著時間的延長酶活力逐漸增大，當發(fā)酵時間為30 h時酶活力達到最大值109.62 U/mL，發(fā)酵液OD值為0.782，自此發(fā)酵液酶活力不再增高，當發(fā)酵時間為36 h時，出現(xiàn)酶活力降低現(xiàn)象，分析原因可能為部分酶活不穩(wěn)定所致。統(tǒng)計分析結果表明，選擇發(fā)酵時間為30 h，酶活力提高了19.67%（P ＜ 0.05）。

3.3.6 發(fā)酵溫度對YZ-ZH03菌株發(fā)酵液菌體濃度及酶活力的影響 選用裝液量50 mL/250 mL三角瓶、接種量2%、180 r/min，測定搖瓶在36、37、38、39℃發(fā)酵30 h后發(fā)酵液菌體濃度及酶活力，試驗結果見圖6。

圖6 發(fā)酵溫度對YZ-ZH03菌株發(fā)酵液菌體濃度及酶活力的影響

試驗結果表明，YZ-ZH03菌株在發(fā)酵過程中隨著溫度的變化其酶活力先增大后減小，當發(fā)酵溫度為37℃時酶活力達到最大值112.25 U/mL，發(fā)酵液OD值為0.751，隨著溫度的增加發(fā)酵液酶活力逐漸降低，統(tǒng)計分析結果表明，選擇發(fā)酵溫度為37℃時發(fā)酵液酶活力提高了22.54%（P＜0.05），對發(fā)酵結果影響顯著。

3.3.7 不同裝液量對YZ-ZH03菌株發(fā)酵液菌體濃度及酶活力的影響 30 h測定裝液量分別為30、50、70、90 mL 的 250 mL 搖瓶發(fā)酵液各項指標，結果見圖7。

圖7 不同裝液量對YZ-ZH03菌株發(fā)酵液菌體濃度及酶活力的影響

試驗結果表明，當裝液量為50 mL時，其酶活力最大，為113.16 U/mL，菌液OD值為0.751，為所有試驗組效果最好。分析其原因為適宜的裝液量為菌株的生長提供了合適的需氧量促進了菌株的生長。統(tǒng)計分析結果表明，選擇裝液量為50 mL時，發(fā)酵酶活力提高了25.72%（P＜0.05）。

3.3.8 不同搖瓶轉速對YZ-ZH03菌株發(fā)酵液菌體濃度及酶活力的影響 30 h時測定不同轉速對酶活力大小及菌液濃度的影響，結果見圖8。

圖8 不同搖瓶轉速對YZ-ZH03菌株發(fā)酵液菌體濃度及酶活力的影響

結果表明，YZ-ZH03菌株培養(yǎng)液在搖床轉速為200 r/min時酶活力最大為119.23 U/mL，OD600為0.782，為其培養(yǎng)最佳轉速。分析原因為適宜的轉速為菌株的生長提供了適宜的發(fā)酵液通氣量，增加了其溶氧量促進了菌株的生長。統(tǒng)計分析結果表明，選擇轉速為200 r/min時酶活力提高了30.16%（P ＜ 0.05）。

3.4 正交試驗 綜合以上各單因素試驗結果，選定 K2HPO4∶KH2PO4為 0.4∶0.1，選擇葡萄糖、尿素、氯化鈉、pH、接種量設計 5因素4水平的 L16（45）正交試驗，結果見表2，方差分析見表3。

表2 正交試驗設計及結果分析

表3 正交試驗結果方差分析

依據(jù)正交試驗的直觀分析結果，極差值R接種量＞R尿素＞RNaCl＞RpH值＞R葡萄糖，可得接種量為主要影響因素。由表2可見，3號試驗組合酶活力大小最高，為 121.69 U/mL，增長了 32.85%（P ＜ 0.05）。而由均值K得出的最佳組合為A1B3C2D2E3，在正交試驗表中沒有該組合，通過驗證試驗證實該組合發(fā)酵液的酶活力大小為122.43 U/mL，比未做優(yōu)化前酶活力提高了33.66%（P＜0.05）。

由表 3 可以看出，F(xiàn)葡萄糖＜F0.05（3.3），即葡萄糖含量對發(fā)酵結果影響不顯著；F尿素＞F0.05（3.3），即尿素含量對發(fā)酵結果影響顯著；FNaCl＜F0.05（3.3），即NaCl含量對發(fā)酵結果影響不顯著；FpH值＜F0.05（3.3），即發(fā)酵液pH值對發(fā)酵結果影響不顯著；F接種量＞F0.05（3.3），即接菌量對發(fā)酵結果影響顯著。綜合分析顯示對發(fā)酵酶活力影響最大的因素是接菌量。最終確定YZ-ZH03的最佳酶活力培養(yǎng)條件為：葡萄糖1.0%，玉米漿1.5%，NaCl 0.10%，K2HPO40.4%，KH2PO40.1%，初始 pH 6.0，接種量4%。

4 討論與結論

經(jīng)過產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌的分離篩選，最終獲得一株產(chǎn)淀粉酶活力較強的芽孢桿菌，并對其產(chǎn)酶發(fā)酵條件進行優(yōu)化，結果表明，發(fā)酵液酶活力與發(fā)酵接種量和氮源的含量有顯著相關性，最終確定產(chǎn)酶發(fā)酵工藝為：葡萄糖1.0%，玉米漿1.5%，NaCl 0.10%，KH2PO40.4%，KH2PO40.1%，初始pH 6.0，接種量4%，250 mL搖瓶中裝液量50 mL，37℃、200 r/min培養(yǎng)30 h。在此條件下，菌株的產(chǎn)酶酶活力由初始的91.60 U/mL提升到122.43 U/mL，提高了33.66%。本試驗菌株的獲得可以為工業(yè)化生產(chǎn)淀粉酶以及微生態(tài)飼料添加劑菌株的選擇提供一定的參考價值。

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