高效液相色譜法測定飼料中左旋咪唑

吳荔琴， 林海丹*， 李小云， 鄧國東， 伍宏凱， 藍棋浩

（1.廣東省獸藥飼料質量檢驗所，廣東廣州 510230；2.廣東省動物衛生監督總所，廣東廣州510230）

左旋咪唑（LMS）屬咪唑并噻唑類抗蠕蟲藥，臨床常用其鹽酸鹽或磷酸鹽。左旋咪唑具有廣譜、高效的特點，但該藥具有潛在的基因毒性，用藥后對消化系統、神經系統、心血管系統、血液及造血系統、泌尿系統和皮膚均有不同程度的毒副作用。左旋咪唑在國內外養殖業中應用極為廣泛，當長期、超量用藥或不執行休藥期規定時，或盲目用藥、重復用藥、配伍不當時，均可產生殘留，直接危害人體健康。本研究建立了檢測配合飼料和濃縮飼料中左旋咪唑的高效液相色譜方法，該方法靈敏、高效、簡便。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備 高效液相色譜儀，Aglient1100型，配UV檢測器，美國Aglient公司；分析天平，感量0.00001 g，CPA-225D型，德國賽多利斯公司；氮吹儀，GM-2100型，日本EYELA公司；超聲波清洗器，SB-5200DTDN型，寧波新芝公司；振蕩器，KS501型，馬來西亞IKA公司；離心機，5804R型，德國Eppendof公司；有機濾膜，孔徑為0.45 μm，天津市騰達過濾器件廠。

1.2 藥品與試劑 左旋咪唑標準品，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，純度≥98.5%；乙腈、甲醇，均為色譜純，德國Merck公司；氫氧化鈉、乙酸乙酯、磷酸二氫鈉、正己烷等均為國產分析純試劑；水為超純水，利用美國Millipore超純水儀自制。

1.3 標準溶液制備 標準儲備液：準確稱取左旋咪唑標準品10 mg（精確至 0.00001 g），于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成1000 μg/mL標準儲備液。

標準工作液：準確量取標準儲備液1 mL，于10 mL容量瓶中，用流動相稀釋并定容至刻度，配制成100 μg/mL標準工作液。

1.4 溶液配制 5 mol/L氫氧化鈉溶液：稱取氫氧化鈉40 g，加水至200 mL，搖勻。0.02 mol/L磷酸二氫鈉溶液：稱取磷酸二氫鈉3.14 g，加水至1000 mL，搖勻。流動相：0.02 mol/L磷酸二氫鈉-乙腈溶液（75∶25，V/V）。

1.5 樣品制備

1.5.1 樣品提取 稱取適量飼料樣品 （配合飼料2 g、濃縮飼料1 g）于 50 mL離心管中，加適量水（配合飼料試樣10 mL、濃縮飼料5 mL），加5 mol/L氫氧化鈉溶液0.2 mL，渦旋混勻1 min，超聲20 min，加入20 mL乙酸乙酯，振蕩30 min，6500 r/min離心5 min，取上清液5 mL于試管中，50℃氮氣吹干，備用。

1.5.2 樣品凈化 殘留物用2 mL流動相溶解，加入正己烷2 mL，渦旋1 min，靜置分層，取下層溶液過濾膜上機測定。

1.6 色譜條件 色譜柱：SCX柱，柱長250 mm，內徑 4.6 mm，粒徑 5 μm；流動相：0.02 mol/L 磷酸二氫鈉乙腈-溶液（75∶25，V/V）；流速：1.0 mL/min；波長：215 nm；進樣量：20 μL。

1.7 檢測限和定量限的測定 按照信噪比S/N≥3時的添加濃度為檢測限，S/N≥10時的添加濃度為定量限，測定方法的檢測限和定量限。

1.8 添加回收率和精密度測定 選擇空白配合飼料、濃縮飼料樣品作為測試對象，進行加標回收率實驗。稱取適量飼料樣品于50 mL離心管中，加入適量標準儲備液，使配合飼料的添加濃度分別為 0.5、75、150、300 mg/kg， 濃縮飼料的添加濃度分別為 1、300、600、1200 mg/kg。 每個添加濃度設6個平行，進行3次重復。當樣品上機液的濃度超過線性范圍時，需稀釋后重新測定，直至上機液濃度在線性范圍內。

2 結果與分析

2.1 標準曲線 準確移取左旋咪唑標準工作液適量，用流動相逐級稀釋配制成濃度為0.1、0.5、1、5、10、20、50 μg/mL 的系列標準溶液， 過 0.45 μm濾膜后上機測定。以左旋咪唑藥物峰為縱坐標，標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線。得到的回歸方程為Y=127.5C+1.973，r=1.0000。結果顯示，左旋咪唑濃度為0.1～50 μg/mL時呈現良好的線性關系（圖1）。

圖1 左旋咪唑標準曲線

2.2 檢測限和定量限 按照信噪比S/N≥3要求確定方法的檢測限，按照信噪比S/N≥10要求確定方法的定量限。結果表明，在配合飼料中的檢測限為0.2 mg/kg，定量限為0.5 mg/kg；在濃縮飼料中的檢測限為0.4 mg/kg，定量限為1 mg/kg。

2.3 回收率和精密度 配合飼料濃度為0.5～300 mg/kg時，回收率為80.5%～102%，批內變異系數為0.6%～6.0%，批間變異系數為2.1%～4.8%；濃縮飼料濃度為1～1200 mg/kg時，回收率為80.1%～107%，批內變異系數為0.7%～9.8%，批間變異系數為2.0%～9.1%。配合飼料及濃縮飼料中左旋咪唑添加回收率測定結果見表1和表2；左旋咪唑標準溶液色譜圖見圖2；代表性配合飼料和濃縮飼料空白添加樣品溶液色譜圖見圖3和圖4。

3 討論

3.1 液相色譜條件的優化 測定左旋咪唑常用C18色譜柱進行分離（林維宣等，2011；曾建亭等和曾勇等，2010），流動相為0.02 mol/L磷酸二氫鈉（加二乙胺，用磷酸調pH值至7.5）-乙腈溶液（75∶25，V/V），紫外吸收波長為 210 nm（曾勇等，2010）。經測試，該條件下，樣品的基線峰波動較大，雜質干擾較多。左旋咪唑是極性較強的化合物，本方法采用強離子交換色譜柱 （SCX，250 mm×4.6 mm，粒直徑5 μm），流動相為0.02 mol/L磷酸二氫鈉-乙腈溶液，基線平穩，雜質干擾少。當流動相比例為75∶25（V/V）時，能把樣品溶液中雜質峰和目標藥物峰較好地分離。二極管陣列掃描最大吸收波長為215 nm。其他液相條件為進樣量20 μL，柱溫30℃。在該液相條件下，左旋咪唑最大吸收波長為215 nm，見圖5。

表1 配合飼料中左旋咪唑添加回收率測定結果

圖2 左旋咪唑標準溶液色譜圖（20 μg/mL）

圖3 配合飼料空白添加色譜圖（0.5 mg/kg）

表2 濃縮飼料中左旋咪唑添加回收率測定結果

圖4 濃縮飼料空白添加色譜圖（1 mg/kg）

3.2 提取方法的確定 根據左旋咪唑的化學性質，在堿性條件下，左旋咪唑有一定的質子化傾向，可以促進目標物質從飼料中提取。當溶液為堿性時，左旋咪唑的電離受到抑制，在水相溶解度降低，易溶于鹵代烷、醚、酯類等弱極性有機溶劑。因此，飼料中左旋咪唑的提取思路是：先在飼料中加入一定量的水和氫氧化鈉溶液，使飼料和目標藥物分散于堿性水溶液中，再用有機溶劑進行提取。

圖5 左旋咪唑光譜圖

3.2.1 加堿量的確定 堿性環境的強弱會影響有機溶劑的提取效果。在加水后的飼料樣品中，若堿性環境太弱，左旋咪唑質子化程度低，降低其在乙酸乙酯中的溶解度；但隨著氫氧化鈉溶液劑量的增加（當pH值大于13），飼料中的脂肪成分會與多余的氫氧化鈉發生反應，生成脂肪酸鈉，黏性越來越大，導致樣品不能與乙酸乙酯充分反應，降低乙酸乙酯的提取效果。在配合飼料和濃縮飼料中分別加入 5 mol/L 的氫氧化鈉 0.1、0.2、0.3、0.5 mL，經比較發現，加入濃度為5 mol/L的氫氧化鈉溶液0.2 mL時，回收率最高。

3.2.2 提取劑的選擇 常用提取劑有：二氯甲烷、三氯甲烷、正己烷、異辛烷和乙酸乙酯。考慮有機溶劑的毒性，比較提取過程中操作的難易程度和回收率的高低。結果顯示，回收率較高的是二氯甲烷和乙酸乙酯，均達到90%以上，但二氯甲烷麻醉性強，且太易揮發，分層后位于下層，不便于取出，因此選擇乙酸乙酯作為提取劑。

3.3 凈化方式的選擇 飼料樣品經乙酸乙酯提取后，脂溶性雜質較多的保留在樣品中，同時左旋咪唑是極性較強的化合物，在酸性水溶液中可用極性較低的有機溶劑進行除脂，因此選擇常用有機溶劑正己烷進行除脂。取5 mL乙酸乙酯提取液，置于50℃水浴中氮氣吹干，再用2 mL流動相定容，并加入一定量的標準溶液，加入2 mL正己烷，渦旋1 min，靜置，取下層溶液過濾膜，上高效液相色譜儀測定，觀察正己烷的除脂效果，測定定容液的pH值，并計算回收率。結果顯示，正己烷能有效除脂，定容液的pH值為5.8～6.0，樣品的平均回收率為99.5%。結果說明，堿化乙酸乙酯經氮氣吹干后對流動相定容液的pH值略有影響，由原來的4.78提高到了6.0，但仍為酸性條件，因此左旋咪唑是以離子形式存在于樣品復溶液中，正己烷的除脂操作并不會減少左旋咪唑的含量。

3.4 同類藥物的干擾 獸醫臨床常用的苯并咪唑類抗線蟲藥有：甲苯咪唑、阿苯達唑以及芬苯達唑。應用本方法色譜條件對上述三種藥物和左旋咪唑的混合標準溶液進行測定。甲苯咪唑、阿苯達唑以及芬苯達唑的出峰時間分別為3.636、3.885、4.142 min，與左旋咪唑的出峰時間（15.361 min）相距較遠，不會干擾左旋咪唑的測定。

3.5 添加濃度的確定 根據《中華人民共和國獸藥典 獸藥使用指南》（中國獸藥典委員會，2010）左旋咪唑內服一次量，每千克體重，豬7.5 mg，禽25 mg，該藥物常用于生長豬或生長雞，根據飼喂畜禽的體重、日采食量，添加劑量約為150 mg/kg才有治療作用。根據《飼料中獸藥及其他化學物監測試驗規程》（全國飼料工業標準化技術委員會，2008），按照方法定量限及該藥物在臨床使用的有效劑量，確定配合飼料的添加濃度分別為0.5（定量限）、75、150、300 mg/kg。 濃縮飼料添加比例與配合飼料相比為8∶2，因此濃縮飼料的添加濃度分別為 1（定量限）、300、600、1200 mg/kg。回收率實驗中，當樣品的上機液濃度超過線性范圍時，需稀釋后重新測定，直至上機液濃度在線性范圍內。

4 結論

本研究建立了飼料中左旋咪唑的高效液相色譜檢測方法，采用堿性環境下乙酸乙酯提取，用正己烷除脂。該方法的回收率為80%～110%，批內變異系數和批間變異系數均小于10%，說明本方法能滿足飼料中左旋咪唑測定的要求。

[1]林維宣，田苗，隋凱，等．高效液相色譜法測定牛乳中左旋咪唑[J]．中國乳品工業，2011，29（1）：24～26．

[2]全國飼料工業標準化技術委員會．GB/T 23182-2008[S]．飼料中獸藥及其他化學物監測試驗規程．北京：中國標準出版社，2008-12-31．

[3]曾建亭，鐘小燕．HPLC法測定鹽酸左旋咪唑片的含量及溶出度[J]．中國熱帶醫學，2010，10（5）：628～629．

[4]曾勇，金秀娥，盧芳，等．豬雞組織中左旋咪唑殘留的HPLC檢測方法研究[J]．中國獸藥雜志，2010，44（8）：17～21．

[5]中國獸藥典委員會．中華人民共和國獸藥典 獸藥使用指南[M]．北京：中國農業出版社出版，2010．1：142～143.