鹽脅迫下深色有隔內生真菌D575對樟子松生長及耐鹽性的影響

鄧 勛，宋小雙，尹大川，崔文峰，宋瑞清

(1．黑龍江省森林保護研究所，哈爾濱150040;2．沈陽農業大學林學院，沈陽110000;3．黑龍江省林業科學院，哈爾濱150040;4．東北林業大學林學院，哈爾濱150040)

樟子松(Pinus sylvestris var．mongolica)是我國北方主要造林樹種，在生態建設、環境修復方面發揮重要作用［1］，我國鹽漬土主要分布在華北、東北和濱海地區，造成森林和草原退化。培育耐鹽樹種或者通過人為引進植物根際有益微生物(包括內生真菌、菌根菌、促生細菌等)與宿主植物的互作實現促進苗木生長、增強苗木抗逆性，并以“菌化苗”形式在后續逆境造林中提高苗木成活率，是實現鹽堿地改造、恢復植被和改善生態的有效途徑。

深色有隔內生真菌(Dark Septate Endophytes，DSE)是植物內生真菌的主要類群，是植物根部的內生菌［2］，從沿海灘涂到內陸高原山地;從熱帶、溫帶到凍原地區及南北極地區均有DSE的分布［3］。在針葉樹中深色有隔內生真菌種類以子囊菌(Ascomycetes)中 的 Phialocephala fortinii s．l．—Acephala applanata species complex(PAC)類群集合為主［4］，在針葉樹的根系中占據主導地位［5］。研究表明，DSE真菌可提高植物抗逆性，包括可提高植物對干旱［6］以及重金屬污染［7-9］等逆境脅迫的抗性、誘導植物產生系統抗性，抵御病原菌生物脅迫［10-12］等。

D575是分離自樟子松根部的深色有隔內生真菌，在離體試驗中［13-14］，表現出較強的耐鹽性，在 CNaCl≤0．4 mol/Lm 和 C Na2SO4≤0．2 mol/Lm的低中濃度鹽脅迫條件下，D575菌絲生長和對碳、磷相對利用率受抑制程度均較低，生長速率同對照相比相差不大，本文在離體研究基礎上，測定內生真菌-樟子松共生體在鹽脅迫條件下的生長及生理相應，探討鹽脅迫條件下，D575對樟子松生長及耐鹽性的影響。

1 材料與方法

1．1 實驗材料

實驗菌株:深色有隔內生真菌D575分離自樟子松根部，經菌落形態和16S rDNA序列測定初步鑒定為Phialocephala fortinii，屬于Phialocephala fortinii s．l．—Acephala applanata species complex(PAC)，為典型的針葉樹種根部深色有隔內生真菌，保存于黑龍江省林業科學院森林保護研究所。

樟子松種子來源:2014年購自遼寧彰武章古臺樟子松苗木繁育基地，由遼寧省防風固沙研究所提供，保存于-20℃冰箱備用。

1．2 樟子松育苗與菌劑制備

(1)無菌制備方法。將草炭土、蛭石和河沙按體積比2∶1∶1的比例配制混合土，置高溫高壓滅菌器中121℃下滅菌2 h，放置7 d后裝入營養缽(直徑15 cm×高13 cm)中備用。

(2)種植處理及播種方法。種子處理及播種參考尹大川［15］方法進行，將經催芽的樟子松種子播入營養缽中，每缽30顆種子，上覆2 cm厚無菌土，澆透水后放入大棚中培養，待幼苗出土后，定苗至每缽20株。進行常規的日常管護，每2 d澆一次水(100 ml/缽)。

(3)菌劑制備方法。用直徑5 mm的無菌打孔器，切取在PDA平板培養基上培養好的內生真菌D575接種于盛有250 mL PD液體培養基的三角瓶(500 mL)中，每瓶接種3片。置于搖床上(25℃、150 r/min)振蕩培養10 d，得到液體菌劑，使用前用攪碎機將菌絲體攪碎做勻漿處理。

1．3 接種及鹽脅迫實驗設計

(1)接種處理。在播種出苗1個月后，進行深色有隔內生真菌的接種處理，設置2種處理方式:處理1:接種深色有隔內生真菌D575(D575);處理2:PD培養基空白對照(CK)。采用液體菌劑，在苗木根際打孔，接種液體菌劑，每缽接種100 ml菌劑，每組處理25盆，共50盆。

(2)鹽脅迫處理設計。參考張峰峰［16］的方法，接種 D575菌劑 1個月后，在 0．1、0．2 mol/Lm NaCl，0．1、0．2 mol/Lm Na2SO4，4 種不同的鹽溶度水平下進行鹽脅迫實驗，以不施鹽為對照。每個處理5個重復，共50盆(2個接種處理×5個鹽脅迫處理×5個重復)盆苗木。結合澆Hoagland營養液，每次每盆澆溶液200 ml，每天澆一次，共澆5次，使達到預計濃度，置于大棚中培養。

1．4 取樣及相關指標測定

在接種3個月后，每處理隨機挖取30株樟子松苗木，進行苗木生長指標測定、菌根合成率調查，生理指標測定、抗氧化酶活性測定、抗病害保護酶活性測定。每個處理3次重復。

(1)生長指標。對于苗高和地徑測定，采用直尺和游標卡尺分別測量，苗木取樣后，用刷子小心清理掉根際泥土，用電子天平測定苗木鮮重后，在鼓風干燥箱中85℃烘干后稱量苗木的干重。

(2)內生菌侵染率。將根尖剪成1 cm長根段，用Phillips＆Hayman的染色方法［17］對根段染色，計算菌根侵染率。菌根菌侵染率(%)=外生菌根菌侵染的根段數/檢查的總根段數×100%，所得結果取平均值。

(3)抗逆生理指標。

可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍G250法測定［18］。

葉綠素與類胡蘿卜素含量測定采用丙酮-乙醇混合液法測定［19］。

抗氧化酶(SOD酶、POD酶、CAT酶)活性采用南京建成生物工程公司的抗氧化檢測試劑盒利用光度計法進行酶活測定［20］。

丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法［21］測定。

游離脯氨酸采用酸性茚三酮比色法［22］測定。

1．5 數據處理

所得數據用SPSS 13．0進行單因素差異顯著性分析(ANOVA)，α=0．05，并以平均值 ±標準差的形式表示。

2 結果與分析

2．1 不同鹽分脅迫對樟子松苗木生物量的影響

(1)對苗高的影響。鹽脅迫和接種內生真菌處理對樟子松苗高均有顯著影響(見表1)，同對照相比，在 NaCl(0．1 ～0．2 mol/Lm)和 Na2SO4(0．1 ～0．2 mol/Lm)脅迫下，未接種D575樟子松苗高降低6．57% ～17．31%，其中對照與 NaCl(0．12 mol/Lm)相比，苗高差異不顯著(P ＞0．05)，NaCl(0．2 mol/Lm)和 Na2SO4(0．1 ～0．2 mol/Lm)處理，未接種D575樟子松苗高之間差異不顯著(P＞0．05)，說明樟子松對低濃度NaCl脅迫有一定的耐受性，而高濃度NaCl和Na2SO4脅迫對樟子松苗木高成長有顯著影響。非鹽脅迫條件下，同對照相比，接種D575苗高增加7．49%，二者存在顯著性差異(P＜0．05)，同時接種D575可緩解鹽脅迫對樟子松苗木生長的抑制作用，在NaCl(0．1～0．2 mol/Lm)和Na2SO4(0．1～0．2 mol/Lm)脅迫下，同對照相比，苗高增加9．32% ～13．26%，鹽脅迫濃度越大，苗高增加越多，說明內生真菌對樟子松促生作用越明顯。在接種D575條件下，低濃度鹽分脅迫(NaCl 0．1 mol/Lm、Na2SO40．1 mol/Lm)對樟子松苗高影響不顯著(P ＞0．05)。

(2)對地徑的影響:同苗高表現相同，不同鹽分脅迫和接種內生真菌均對對樟子松苗木地徑均有顯著影響(見表1)，不同處理條件存在顯著性差異(P＜0．05)。非鹽脅迫條件下，接種D575同對照相比，樟子松苗木地徑提高7．61%，二者存在顯著性差異(P＜0．05)。在接種內生真菌D575條件下，不同鹽分脅迫處理后，對照相比地徑增加6．09% ～10．34%。在接種 D575條件下，低濃度NaCl(0．1 mol/Lm)對樟子松地徑影響不顯著(P＞0．05)。

(3)對生物量的影響:不同鹽分脅迫和接種內生真菌對樟子松苗木鮮重和干重均有顯著影響(見表1)，不同處理之間生物量存在顯著性差異(P＜0．05)。非鹽脅迫條件下，在接種內生真菌D575后，同對照相比，對樟子松苗木鮮重和干重分別提高20．00%和19．81%，可明顯促進生物量積累，增加抗逆性。鹽脅迫處理后，接種內生真菌D575可促進樟子松苗木鮮重增加7．40% ～14．28%，干重增加5．19% ～16．86%，結果表明，內生真菌的存在可消除部分鹽脅迫的影響，增加宿主植物生物量的積累。

表1 鹽脅迫下深色有隔內生真菌D575對樟子松生物量的影響Tab．1 The effect of endophyte fungi D575 on P．sylvestris var．Mongolica biomass under salt tolerance

2．2 不同鹽分脅迫對內生菌侵染率的影響

鹽脅迫的存下降低內生菌的侵染率(如圖1所示)，其中低濃度NaCl(0．1 mol/Lm)同對照相比，內生菌侵染率不存在顯著性差異(P＞0．05)，而NaCl(0．2 mol/Lm)和 Na2SO4(0．1 ～0．2 mol/Lm)脅迫下，同對照相比，內生菌侵染率存在顯著性差異(P＜0．05)，結果表明，不同濃度鹽分脅迫對內生菌侵染效果的影響不同。

圖1 不同鹽脅迫對內生菌侵染率的影響Fig．1 The infection rate of endophyte fungi D575 under different salt tolerance

2．3 不同鹽分脅迫對樟子松苗木生理指標的影響

(1)對苗木葉綠素和可溶性蛋白的影響。研究結果表明，無論是否接種內生真菌，鹽脅迫后宿主植物的葉綠素含量均有所降低(見表2)，接種內生真菌后，同對照相比，可提高宿主植物葉綠素含量，從而提高植物的光和效率，生物量增加。非鹽脅迫條件下，接種內生真菌對葉綠素a和b分別提高25．59%和36．12%。不同處理之間差異顯著(P＜0．05)。在 NaCl(0．1 ～ 0．2 mol/Lm)和 Na2SO4(0．1～0．2 mol/Lm)脅迫下，接種內生真菌后，同對照相比，葉綠素a增加28．13% ～32．66%，葉綠素b增加28．36% ～37．19%，鹽分脅迫濃度越大，葉綠素增加越多，表明內生真菌對宿主植物的促進作用越高，提高植物耐鹽效應越顯著。可溶性蛋白含量也是衡量益生菌對植物促生作用的指標，非鹽脅迫條件下，同對照相比，宿主植物可溶性蛋白含量提高 21．01%，在 NaCl(0．1 ～0．2 mol/Lm)和 Na2SO4(0．1 ～0．2 mol/Lm)脅迫下，同對照相比，可溶性蛋白含量增加14．55% ～25．43%，接種內生真菌后，NaCl(0．1～0．2 mol/Lm)和Na2SO4(0．1 mol/Lm)脅迫處理，可溶性蛋白含量變化同對照相比，差異不顯著(P＞0．05)，而未接種內生真菌5種處理之間差異均不顯著(P＞0．05)，說明鹽脅迫對植物可溶性蛋白含量影響不明顯。

表2 鹽脅迫下深色有隔內生真菌D575對樟子松苗木生理指標的影響Tab．2 The effect of endophyte fungi D575 on P．sylvestris var．Mongolica physiological index under salt tolerance

(2)對保護酶活性的影響。植物在非生物脅迫條件下會直接或間接形成過量的活性氧自由基(ROS)，對植物細胞膜系統具有破壞作用，逆境條件下，植物體內的保護酶系統能夠清除多余的自由基，從而提高植物抗逆性，不受逆境脅迫傷害［23］。超氧化物岐化酶(SOD酶)、過氧化物酶(POD酶)和過氧化氫酶(CAT酶)是植物重要的保護酶，非鹽脅迫條件下，接種內生真菌D575后，樟子松苗木SOD酶、POD酶和CAT酶通對照相比分別增加30．08%、54．49%和42．85%，可顯著提高植物的抗逆性(見表3)。在鹽脅迫條件下，同對照相比，SOD酶活增加29．65% ～35．11%，POD酶活增加50．55%-55．83%，CAT 酶 活 增 加 41．37% ～47．05%。均有大幅度的提高，進一步證明，內生真菌D575的存在，可顯著提高植物的抗逆性，有效抵御鹽脅迫對植物的傷害。

(3)對丙二醛含量的影響。活性氧代謝是植物對逆境脅迫的初始反應，鹽脅迫條件下，植物體內活性氧的積累加劇，導致膜質過氧化產物丙二醛含量迅速增加，而內生真菌可提高宿主植物保護酶系活性，從而清除鹽脅迫所產生的超氧自由基和活性氧，減輕逆境對宿主植物的傷害［24］。未接種內生真菌D575條件下，鹽脅迫處理后，樟子松丙二醛含量顯著增加(見表3)，而無論是否有鹽脅迫，D575的存在均降低了植物體內的丙二醛含量，在NaCl(0．1 ～0．2 mol/Lm)和 Na2SO4(0．1 ～0．2 mol/Lm)脅迫下，同對照相比，丙二醛含量分別降低13．33% ～17．91%，鹽脅迫濃度越高，降低效果越明顯，證明內生真菌可降低宿主植物丙二醛含量，降低鹽分對植物的傷害。

(4)對脯氨酸含量的影響。植物在逆境下積累脯氨酸具有一定普遍性，脯氨酸可作為滲透調節物、膜和酶的保護物質及自由基清除劑等，而對植物起保護作用［25］。在未接種條件下，非鹽脅迫的樟子松脯氨酸含量低于鹽脅迫下樟子松的脯氨酸含量，差異顯著(P＜0．05)(見表3)，說明鹽分脅迫提高了樟子松脯氨酸含量。無論是否有鹽脅迫，接種D575均可降低樟子松體內脯氨酸含量。在NaCl(0．1 ～0．2 mol/Lm)和 Na2SO4(0．1 ～0．2 mol/Lm)脅迫下，同對照相比，丙二醛含量分別降低25．04% ～38．01%。

表3 鹽脅迫下深色有隔內生真菌D575對樟子松抗逆指標的影響Tab．3 The effect of endophyte fungi D575 on P．sylvestris var．Mongolica stress resistance physiological index under salt tolerance

3 結論與討論

(1)深色有隔內生真菌D575可侵染樟子松，在與宿主植物互作過程中，通過提高宿主植物葉綠素含量，增強光合作用效率，進而增加苗高、地徑和干物質積累。

(2)深色有隔內生真菌D575可提高樟子松苗木耐鹽性，與宿主植物互作后提高保護酶(SOD酶、POD酶和CAT酶)活性、同時降低丙二醛和游離脯氨酸含量緩解鹽脅迫對宿主植物的傷害。

植物根際益生菌與宿主植物的互作機制是近年研究的熱點問題，通過人為引入植物根際益生菌可促進植物生長和養分吸收，提高宿主植物抗逆性，并在生態修復中發揮重要作用。益生菌提高植物耐鹽性機制包括:緩解植物細胞中過量活性氧自由基的積累，誘導植物細胞產生糖類和氨基酸等能夠調節滲透壓的物質緩解植物的滲透壓壓力，減少由逆境環境所誘導產生的丙二醛等應激化合物產生［26］。如玉米接種丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)、熒光假單胞菌(P．fluorescens)、產腸桿菌(Enter-obacter aerogenes)后，對鹽堿環境的耐受性顯著提高［27］。菌根菌可顯著提高植物耐鹽性［28-31］，外生菌根菌如 Suillus bovinus、S．luteus［16］、Laccaria bicolor對一定濃度的鹽脅迫有較強的耐受性，并且可以顯著提高針葉樹種的耐鹽堿能力，Picea glauca和Pinus banksiana的實生苗在接種L．bicolor后，明顯提高了兩種針葉樹在鹽脅迫土壤上的存活率和生長量［32］，與對照相比，針葉受到脅迫的傷害明顯減少［33］。

深色有隔內生真菌是針葉樹重要的根際微生物，針葉樹根部深色有隔內生真菌以Phialoceph ala fortinii s．l．—Acephala applanata species complex(PAC)類群集合為主，同菌根菌相比，其對宿主植物的益生作用研究較少，如通過代謝抑菌成分抑制病原菌、篩選低毒菌株控制土壤病原菌等方面證明了其生物防治能力［34-37］，但目前還沒有其與宿主植物互作提高耐鹽性的報道。離體實驗證明，深色有隔內生真菌對鹽脅迫具有較強的耐受性［13-14］，在 CNaCl≤0．4 mol/Lm 和 C Na2SO4≤0．2 mol/Lm的低中濃度鹽脅迫條件下，D575菌絲生長和對碳、磷相對利用率受抑制程度均較低，生長速率同對照相比相差不大。通過人工接種實驗進一步證明內生真菌D575可提高宿主植物對鹽脅迫的耐受性，增加植物生物量積累，如在NaCl和Na2SO4脅迫下，同對照相比，苗高增加9．32% ～13．26%，鹽脅迫濃度越大，苗高增加越多，說明內生真菌對樟子松促生作用越明顯。此外，接種內生真菌D575后，顯著增加植物體內保護酶活性，并降低丙二醛和游離脯氨酸的含量，最大程度降低鹽脅迫對植物的傷害。上述實驗為進一步田間實驗打下基礎。

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