木霉菌劑與重茬凈復配防治平貝黑腐病及對平貝誘導抗性

宋小雙，遇文婧，周 琦，鄧 勛

(黑龍江省森林保護研究所，哈爾濱150040)

隨著黑龍江省森工全面停止商業性采伐和經營模式轉型，林下經濟已經成為森工林業經濟中的重要增長點［1］。北藥栽培是森工林下經濟的重要板塊，其中平貝栽培是部分林業局的支柱產業之一。平貝系百合科多年生草本植物平貝母(Fritillaria ussuriensis)干燥的鱗莖，性味平苦，具有清熱解毒、潤肺止咳化痰的功效［2］。

黑腐病是平貝最重要的病害，又名菌核病，屬于土傳病害，以土壤為媒介進行傳播，嚴重可導致平貝絕產［3-4］，目前黑腐病主要以化學防治為主，但效果不理想，多年的化學防治導致病原菌抗藥性增加，土壤退化，重茬障礙問題發生嚴重。隨著藥用植物栽培的規范化，生物防治技術日益受到重視［5-9］，通過人為引進植物根際有益微生物(包括生防菌)與土壤生物改良劑，在有效控制病害發生的同時，促進植物生長、增強抗逆性，并達到改良土壤理化結構和微生態系統的目的。對于藥用植物包括人參、西洋參、田七等的土傳病害生物防治及其生態控制研究的均有深入研究，包括連坐障礙發生機制［10-14］、拮抗菌株的分離篩選［15-19］、生防作用機理［20］、菌劑田間應用［21-22］等，而平貝土傳病害研究較少，本研究在分離鑒定平貝黑腐病致病菌基礎上，采用生物防治和土壤改良技術相結合，對平貝黑腐病的生態控制進行探討。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

(1)試驗用菌株。綠木霉(Trichoderma virens)T43為從以色列引進高效菌株，對多種植物病害均有高效的防治效果［23-30］，保存于東北林業大學森林微生物實驗室。平貝黑腐病病原菌核盤菌PB-06(Sclerotinia sclerotiorum):分離自黑龍江省牡丹江市海林林業局三十五林場平貝栽培基地，保存于黑龍江省森林保護研究所。

(2)土壤改良劑。重茬凈復合生物菌肥購自武漢金禾生物科技公司;土壤消毒劑:敵克松(敵磺鈉)購自山東天威農藥有限公司。

1．2 綠木霉T43及其發酵液對平貝黑腐病菌的抑制作用

(1)拮抗作用。采用平板對峙培養法［31］，在接種培養黑腐病菌5 d后，接種木霉菌T43，48 h后測量菌落半徑，計算抑制率，并對對峙拮抗線進行觀察和描述，每個處理3次重復。

抑制率= ［(對照菌落半徑-對峙培養菌落半徑)/對照菌落半徑］ ×100%。

(2)發酵液抑菌實驗。采用菌絲生長抑制法［32］，參考鄧勛［29］方法制備非揮發性代謝產物后添加到PDA培養基中，使終濃度達到20%，以不添加代謝產物的PDA平板作對照，25℃恒溫培養7d，采用十字交叉法測量病原菌的菌落直徑，計算木霉代謝產物對病原菌生長的抑制率，每個處理3次重復。

抑制率= ［(對照菌落半徑-抑制培養菌落半徑)/對照菌落半徑］ ×100%。

1．3 平貝黑腐病生物-化學防治實驗設計

(1)防治地點及概況。位于牡丹江市海林林業局三十五林場平貝栽培基地，平貝種植面積124 hm2，平貝栽培始于1980年，為多年連作栽培模式，林場年有效積溫2 400℃。全年日照時數2 540 h。年平均降水量550 mm。無霜期125 d左右，近年平貝黑腐病、灰霉病發生嚴重，發病率50%以上。

(2)防治時間:2013年6月。

(3)防治實驗設計。使用藥劑包括生防菌綠木霉、土壤改良劑重茬凈、土壤消毒劑敵克松不同組合，試驗設計如下:①綠木霉;②重茬凈;③敵克松;④綠木霉+重茬凈;⑤綠木霉+重茬凈+敵克松;⑥對照，每處理面積50 m2，在6月份平貝采收栽培同時，采用拌土的方式施用藥劑。

1．4 調查指標及統計分析

(1)防治效果調查。2014年5月份進行防治效果調查，在不同防治處理區分別取樣，調查平貝地下鱗莖黑腐病發病情況，統計發病鱗莖和健康鱗莖數量，計算發病率和防治效果。

相對防治效果(%)= ［(對照發病率-處理發病率)/對照發病率］ ×100%。

(2)不同處理對平貝根際微生物群落的影響。分別在2013年7月和2014年5月兩次采集平貝根際土樣，采用平板計數法［33］統計平貝根際真菌、細菌和放線菌數量，評價不同處理對土壤微生物群落的影響和土壤改良作用。

(3)對主要生理指標的影響。2014年5月采集平貝樣品，測定生理指標。

可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍G250法測定［34］。

葉綠素與類胡蘿卜素含量測定采用丙酮-乙醇混合液法測定［35］。

抗氧化酶(SOD酶、POD酶、CAT酶)活性采用南京建成生物工程公司的抗氧化檢測試劑盒利用光度計法進行酶活測定［36］。

2 結果與分析

2．1 木霉菌對平貝黑腐病菌的離體測試

對峙培養結果表明綠木霉T43對平貝黑腐病菌PB-06有較好的拮抗作用，對病原菌的抑制率為60．23%，對峙培養后期，綠木霉菌落完全覆蓋病原菌菌落，體現了極強的競爭作用。同時綠木霉發酵液提取物也可以明顯抑制平貝黑腐病菌PB06的菌絲生長，抑制率為62．58%，病原菌菌落生長緩慢，菌絲稀疏，氣生菌絲較多。

2．2 平貝黑腐病生物-化學防治

為有效控制平貝黑腐病，本次實驗設計采用了生防菌劑(木霉菌劑)、土壤改良劑(重茬凈)和土壤消毒劑(敵克松)分別對平貝黑腐病進行了防治研究，通過調查植株發病率，結果表明木霉菌結合土壤改良劑重茬凈可有效控制平貝黑腐病的發生(見表1)。不同處理之間差異顯著(P＜0．05)，由于多年連作，平貝黑腐病菌對化學殺菌劑形成了較強的抗性，單獨使用敵克松后，對病害的相對防治效果只有36．01%，而綠木霉+重茬凈效果最好，相對防治效果達到69．24%，其次是綠木霉+重茬凈+敵克松，相對防治效果為64．58%。目前的統計結果是防治第一年的效果，而平貝從栽培到采收，要連續在土壤中存留2 a周期，因此，防治效果的持續性，需要到下一點繼續調查。

表1 平貝黑腐病的生物-化學防治效果Tab．1 Bio-chemical control effect on F．ussuriensis black rot

2．3 對平貝根際微生物群落的影響

通過生物—化學防治技術可有效控制平貝黑腐病的發生，通過統計防治前后平貝根際微生物群落的數量變化，可以間接反映對平貝連作土的改良和修復作用(見表2)，我們對平貝健康和受害植物根際的微生物群落也進行了統計分析(數據未在此展示)，以闡明其發病機理，研究結果表明，連作年份越長，其微生物生態系統越趨向于單一，同時真菌數量明顯高于正常數量，而細菌數量與不連作土壤相比，更加豐富。而通過生物-化學防治技術在有效控制平貝黑腐病發生的同時，對連作土的生物修復作用也起到了明顯的效果，同防治前相比，除單獨使用敵克松外，綠木霉、重茬凈、綠木霉+重茬凈以及綠木霉+重茬凈+敵克松的組合均提高了土壤中細菌和防線菌的數量，豐富了微生物種群，而木霉菌處理組合中，真菌數量的增加，通過平板培養證明是木霉菌在土壤中有效定殖，提高了土壤中真菌的數量。

2．4 對平貝主要生理指標的影響

木霉菌T43對植物具有促生抗逆作用，而土壤改良劑重茬凈主要生物成份為生防細菌和放線菌，在有效控制病害發生的同時，對土壤改良和修復也起到了重要作用。2種生物菌劑在使用后，對平貝的主要生理指標包括可溶性蛋白含量和葉綠素含量均有提高作用(見表3)。其中綠木霉+重茬凈組合同對照相比，平貝可溶性蛋白含量提高30%左右，大大增加了平貝的干物質含量，在后續研究中，通過測定平貝主要活性成分含量的變化對生物菌劑施用的響應作用，可以進一步說明生物制劑對平貝植株生長的影響。平貝植株保護酶包括SOD、CAT和POD在施用生物菌劑后均有一定程度的提高(見表4)，提高幅度在10% ～20%之間，說明平貝植株的抗逆性提高，對黑腐病的發生也起到一定的抑制作用。

表2 生物-化學防治技術對平貝根際微生物群落的影響Tab．2 The effect of bio-chemical control on F．ussuriensis rhizosphere microbial community

表3 生物-化學防治技術對平貝葉片主要生理指標的影響Tab．3 The effect of bio-chemical control on F．ussuriensis leaf physiological index

表4 生物-化學防治技術對平貝植株保護酶活性的影響Tab．4 The effect of bio-chemical control on F．ussuriensis protective enzyme activity

3 結論與討論

(1)采用生防菌劑(木霉菌)+土壤改良劑(重茬凈)+土壤消毒劑(敵克松)的不同組合對平貝黑腐病的田間防治進行研究，結果表明木霉菌+重茬凈組合可有效控制病害發生，對平貝黑腐病的相對防治效果達到69．94%。

(2)生物菌劑的使用可有效改良平貝連作土中微生物群落結構，改變病原菌占主導地位的格局，增加細菌和放線菌生物量，使土壤微生態系統保持穩定。

將不同生防菌和土壤微生物改良劑復配，發揮各自的優勢和協同作用，可以降低植物病害的發病率，增強防治效果［37］。木霉菌T43對多種植物病害均有高效的防治效果［23-30］，競爭優勢在于產孢量大、易于擴大生存空間，同時代謝抑菌活性成分。重茬凈含有多種益生細菌，具有改良土壤的作用。本研究將木霉與重茬凈復配施用，對平貝黑腐病進行防治，相對防效可達69．94%，能夠實現不同生防機制同時起作用，避免了單一生防菌應用導致的病原微生物抗性的產生。多種生防菌復配使用是解決土傳病害和重茬障礙的有效途徑，張愛華用2種生防細菌復配對西洋參銹腐病的盆栽和田間相對防效分別達到88．93%和44．57%，可有效控制病害的發生［21］。長柄木霉和涇陽鏈霉菌兩種生防菌復配，對煙草黑脛病的相對防治效果達到了69．3%［38］。木霉菌與土壤改良劑的復配使用對平貝的增產機制有待于進一步研究。

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