溫度對雞骨酶解液-木糖美拉德反應產物中非揮發性物質的影響

鄭曉杰，林勝利，聶小華，許丹

1(溫州科技職業學院(浙江溫州市農業科學研究院)，浙江溫州，325006)

2(浙江工業大學海洋學院，浙江 杭州，310014)

雞骨是肉雞加工過程中產生的大宗副產品，約含12%的蛋白質;其酶解液常用作食品調味料基料，廣泛應用于方便食品、膨化食品與肉制品等生產中。但由于雞骨酶解液風味不足，使用前需要進行風味調制，而美拉德反應是蛋白酶解物增香的有效手段。安廣杰等［1］將雞骨架酶解液添加一定的輔料后進行美拉德反應制得優良的雞肉香精;孫紅梅等［2］應用模糊數學感官評價方法優化得到雞骨素美拉德反應的工藝參數。已有研究表明，美拉德反應產物肉味強度比傳統的煮雞或烤雞的肉味強80～100倍［3］。

目前雞骨資源的研究多集中于酶解工藝［4-5］、酶解液美拉德反應工藝［1-2］及揮發性物質分析［6］等方面，而雞骨酶解液美拉德反應產物中非揮發性物質的相關研究很少。本文以雞骨酶解液為原料，在不同溫度下進行雞骨酶解液與木糖之間的美拉德反應，研究其反應產物中游離氨基酸、肽類等非揮發性物質的變化規律。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷凍雞骨架，市售，去除表層肌肉與脂肪;木瓜蛋白酶(60萬U/g)、胰酶(1400U/g)、中性蛋白酶(4.7萬U/g)，購于河南華森食品配料有限公司。

SpectraMax M2多功能酶標儀，美國MD公司;紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司;CR22N/CR21N高速冷凍離心機，日本日立公司;SYKAM S-433D全自動氨基酸分析儀，德國SYKAM公司;Waters 600高效液相色譜儀，美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 雞骨酶解液的制備

稱取一定量的雞骨，加入1∶1.5(g∶mL)水后于130℃高壓蒸煮20 min，勻漿后于50℃和自然pH下進行復合酶酶解，其中復合酶為木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶(1∶2∶1)，添加量為1 g原料添加2 200 u;酶解3.5 h后于100℃下處理15 min，冷卻，離心去沉淀，上清液即為雞骨酶解液。

1.2.2 雞骨酶解液的美拉德反應

取雞骨酶解液50 mL，加入木糖2.0 g，分別于不同溫度下反應90 min，即為雞骨酶解液的美拉德反應產物。

1.2.3 pH的測定

采用數字酸度計直接測定美拉德反應產物中pH值。

1.2.4 褐變程度的測定

將美拉德反應產物稀釋25倍后，于420 nm處測定吸光值。

1.2.5 自由氨基的測定

采用鄰苯二甲醛法(oPA法)［7］。將美拉德反應產物稀釋100倍后，取0.1 mL稀釋液加入3 mL 0.05 mol/L硼砂緩沖溶液(含0.8 mg/mL OPA，1%SDS，2 μg/mL β-巰基乙醇)，混勻，室溫下反應 3 min，于340 nm下測定吸光度。以賴氨酸繪制標準曲線，吸光值轉換為賴氨酸濃度當量。

1.2.6 游離氨基酸的分析

取10 mL美拉德反應產物，加入等體積10%三氯乙酸，過濾沉淀，取濾液，采用SYKAM S-433D全自動氨基酸分析儀進行分析。

1.2.7 肽分子量分布的分析

將美拉德反應產物稀釋5倍后，微孔濾膜過濾。采用Waters 600高效液相色譜儀(配2487紫外檢測器和Empower工作站GPC軟件)測定。色譜柱:TSK-gel 2000 SWXL 300 mm ×7.8 mm;柱溫:30℃;流動相:乙腈/水/三氟乙酸(45∶55∶0.1，體積比);流速:0.5 mL/min;檢測波長:220 nm。分子量校正曲線所用標準品為細胞色素C、桿菌酶、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸。

1.2.8 數據分析

實驗數據采用SPSS18.0軟件中Duncan法進行各組之間的顯著性分析(P＜0.05)，采用Origin8.0對數據進行繪圖。

2 結果與討論

2.1 溫度對雞骨酶解液-木糖美拉德反應產物中pH值和褐變程度的影響

已有研究表明，美拉德反應過程中可消耗游離氨基基團和產生甲酸、乙酸等酸性物質，從而導致反應體系pH值下降［8］，因此pH值是衡量美拉德反應程度的重要參數。圖1表明，雞骨酶解液經美拉德反應后，其pH值顯著下降，由起始的6.09降至4.77～4.45，但各美拉德反應產物之間不存在顯著性差異。這可能是因為起始pH值為弱酸性，美拉德反應程度緩慢，無法體現出不同溫度下雞骨酶解液美拉德反應產物pH之間的差異。

褐變程度是檢測美拉德反應進展的另一個重要指標，常用420 nm處吸光度來表示，A420nm值增加表明美拉德反應最后階段褐色素的產生。由圖1可知，雞骨酶解液美拉德反應產物中A420nm值隨著反應溫度的增加而快速增加，與反應溫度之間呈現顯著的正相關性;當反應溫度為100℃時，A420nm值比對照組增加了7倍以上。Lan等亦認為溫度很大程度上影響著大豆肽-木糖美拉德反應體系的褐變程度［9］。

圖1 溫度對雞骨酶解液-木糖美拉德反應產物中pH值和褐變程度的影響Fig.1 Effect of temperature on pH and browning in Maillard reaction products

2.2 溫度對雞骨酶解液-木糖美拉德反應產物中自由氨基的影響

美拉德反應中蛋白質、肽類或氨基酸的α-或ε-氨基與還原糖類發生共價結合，消耗的自由氨基越多，反應越徹底。由圖2可知，雞骨酶解液美拉德反應產物中自由氨基含量發生顯著降低，其含量損失隨著反應溫度增加而增加;溫度高于90℃，雞骨酶解液美拉德反應比較徹底，自由氨基由起始的388.23 mmol/L降至 300～310 mmol/L，損失率分別為20.22%(90℃)和21.79%(100 ℃)。JIANG 等［7］研究酪蛋白-半乳糖美拉德反應時亦發現，在pH5～6、95℃下反應2 h，自由氨基損失率較低，約為15%～20%;只有當pH＞9.0時自由氨基才被大量消耗，這主要因為堿性、高溫的環境更有利于美拉德反應進行。此外，雞骨酶解液美拉德反應產物中自由氨基含量的降低與反應溫度、褐變程度的增加均存在正相關性，劉蒙蒙［10］、ZENG［11］等亦報道了相似結論。

圖2 溫度對雞骨酶解液-木糖美拉德反應產物中自由氨基的影響Fig.1 Effect of temperature on amino groups in Maillard reaction products

2.3 溫度對雞骨酶解液-木糖美拉德反應產物中游離氨基酸的影響

游離氨基酸是美拉德反應的重要底物，其參與美拉德反應的活性各有不同。由表1可知，雞骨酶解液中共檢出15種游離氨基酸，總量為14 404.2 mg/L。經美拉德反應后游離氨基酸總量顯著降低至7 271.2～7 756.7 mg/L，這主要源于氨基酸和糖類之間的交聯反應，其中損失變化較大的游離氨基酸依次是丙氨酸、色氨酸、蘇氨酸和亮氨酸，這說明上述4種游離氨基酸具有較強的美拉德反應活性，且總體上其損失率與反應溫度呈現正相關性，經100℃反應90 min后分別降低了97.57%、67.60%、57.08%和50.95%。而天冬氨酸和甘氨酸含量隨著反應溫度的增加而增加，尤其是在100℃反應體系中分別增加了51.37%和19.19%，這可能是因為在弱酸、高溫下肽降解作用生成的游離氨基酸大于美拉德反應消耗的游離氨基酸;LAN等［9］認為，還原糖的存在改變了肽的結構，有助于肽在高溫下降解生成氨基酸。此外，雞骨酶解液-木糖美拉德反應中半胱氨酸、纈氨酸、組氨酸和賴氨酸等含量變化不大。但趙謀明等研究發現，雞肉蛋白肽-葡萄糖美拉德反應體系中精氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸降解率最高［12］。

表1 溫度對雞骨酶解液-木糖美拉德反應產物中游離氨基酸的影響 單位:mg/LTable 1 Effect of temperature on free amino acids in Maillard reaction products

2.4 溫度對雞骨酶解液-木糖美拉德反應產物中肽分子量分布的影響

蛋白酶解液中存在著不同分子量肽段，不僅發生熱降解產生美拉德反應的中間產物，而且直接參與美拉德反應［13］。由表2可知，雞骨酶解液-木糖美拉德反應產物中分子量＞500 Da的5個組分含量均發生顯著下降，同時伴隨著分子量＜500 Da的組分含量明顯增加。據此推測弱酸條件下美拉德反應體系中肽段的熱降解作用遠大于交聯作用;趙謀明、劉平等亦報道了不同分子量肽段在美拉德反應過程中存在著熱降解情況［12，14］。對不同溫度的美拉德反應產物進行比較，隨著反應溫度增加，分子量＞5000 Da的組分略有增加，3000～5000 Da和2000～3000 Da的組分表現出先降后增加，1000～2000 Da和500～1000 Da組分含量逐步降低，分子量＜500 Da的組分則呈現逐步增加，這說明溫度越高肽段更易發生美拉德反應，雞骨酶解液中各肽段與木糖發生美拉德反應的能力不同，其中1000～2000 Da和500～1000 Da組分具有較高的美拉德反應活性，該肽段可能含有較高反應活性的末端氨基酸。

表2 溫度對雞骨酶解液-木糖美拉德反應體系中肽分子量分布的影響Table 2 Effect of temperature on peptides in Maillard reaction products

3 結論

隨著反應溫度的增加，雞骨酶解液-木糖美拉德反應程度增加，pH明顯降低，褐變程度的增加、自由氨基含量的減少均與溫度呈現正相關性;經美拉德反應后大部分游離氨基酸和肽段等含量顯著下降，其中丙氨酸、色氨酸、蘇氨酸和亮氨酸等氨基酸和1 000～2 000 Da和500～1 000 Da組分具有較高的美拉德反應活性。

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