土壤桿菌exoR基因缺陷株生長及其熱凝膠合成特性*

趙忠勝，朱德強，王永遠，鄭志永，詹曉北

(糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江南大學生物工程學院，江蘇無錫，214122)

熱凝膠是一種水不溶性β-(1，3)葡聚糖線性分子［1］，由土壤桿菌(Agrobacterium sp.舊名 Alcaligenes faecalis)、根瘤菌等微生物在氮源限制條件下分泌產生［2］。熱凝膠分子在中性或酸性條件下會形成右手三螺旋結構［3］，具有熱成膠性、抗凍融性及抗脫水性等特點，在食品工業具有廣泛應用。

國內外學者對熱凝膠的生產工藝做了比較深入的研究，Lee等用蔗糖或糖蜜為碳源進行熱凝膠發酵研究，采用兩步補料發酵工藝，第一步用來培養菌體，第二步用氮源限制來進行熱凝膠的合成［4］。國內采用培養基的優化［5］、碳源氮源的連續流加［6］及添加高能磷酸鍵前體物質［7］等多種發酵策略用于提高熱凝膠的產量。提高菌體濃度能明顯提高熱凝膠產量。增加氮源，能提高菌體濃度，進而提高熱凝膠的產量［6］。然而過多的增加菌體濃度，會使菌體消耗較多的碳源，降低了單位碳源的熱凝膠轉化率［8］。熱凝膠合成及調控機理目前尚不十分明確，通過分子生物學手段強化熱凝膠合成的研究少有報道。已經完成 Agrobacterium sp.ATCC 31749 全基因組測序［9］，通過其基因組的對比分析發現，土壤桿菌中exoR基因與根瘤菌的exoR高度同源。在根瘤菌中，exoR是一類產胞外多糖的負調節因子，其在細胞周質中與exoS相互作用，抑制exoS/chvI雙組分信號。exoS以二聚體的形式附著在于內膜上，其位于周質空間的傳感器結構域負責識別環境信號分子。信號被識別后，磷酸化的exoS激酶激活該系統中的chvI響應調節器。chvI能抑制 exoY，exoP，exoQ，exoA，exoF 基因的表達，進而抑制受調控胞外多糖的產生［10-11］。

Agrobacterium sp.中熱凝膠合成代謝組分exoR的功能及其在熱凝膠合成方面的調節機理并不清楚。exoR作為一類產胞外多糖負調節因子，極有可能參與Agrobacterium sp.合成熱凝膠的代謝調控。基于上述考慮，本文嘗試通過三親結合法［12］敲除Agrobacterium sp.ATCC 31749基因組中的exoR基因，通過搖瓶發酵研究ΔexoR突變株的生長特性及exoR在合成熱凝膠的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

實驗采用的菌株，質粒和引物見表1。

1.1.2 主要試劑和儀器

1.1.2.1 主要試劑

限制性內切酶購自Fermentas公司;Taq DNA聚合酶、氨芐青霉素(Amp)、硫酸鏈霉素(Str)、慶大霉素(Gm)、卡那霉素(Kan)、質粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、PCR產物純化試劑盒等，購自上海生物工程公司;PrimeSTAR酶、Solution I連接液、dNTPs、pMD-19 Simple T vector等，購自中國 TaKaRa公司。

1.1.2.2 主要儀器

TG16-WS臺式高速離心機，湖南湘儀離心機儀器有限公司;Bioer Little Genius PCR儀，杭州博日科技有限公司;JY300型電泳儀，君意東方電泳設備有限公司;上清液用高效液相色譜儀，日本島津。

表1 實驗所使用的菌株，質粒和引物Table 1 Strains，plasmids andprimers used in this work

1.1.3 培養基

大腸桿菌菌株均采用LB培養基，在37℃，搖床轉速200 r/min培養。Agrobacterium sp.系列菌株培養條件為30℃，搖床轉速200 r/min，培養基組成如下:

斜面培養基(g/L):葡萄糖40，酵母粉5.0，瓊脂粉 2.0，CaCO35.0，pH 7.0～7.2。

種子培養基(g/L):葡萄糖20，酵母粉10，KH2PO41.74，MgSO40.5，pH 7.0～7.2。

發酵培養基(g/L):葡萄糖50，酵母粉1.0，KH2PO42.7，K2HPO4·3H2O 2.23，NH4Cl 2.0，MgSO40.5，CaCO35.0，10 mL 無機鹽濃縮液，pH 7.0～7.2。

無機鹽濃縮液(g/L):FeCl3·6H2O 1.0，NaCl 1.0，CaCl21.0，MnCl21.0。

1.2 方法

1.2.1 種子培養

從斜面上挑取1環菌，接入裝有50 mL種子培養基的500 mL三角瓶中，于30℃、200 r/min搖床培養18 h。

1.2.2 搖瓶發酵培養

將2.5 mL種子液接入裝有50 mL發酵培養基的500 mL三角瓶，于30℃、200 r/min搖床培養72 h。

1.2.3 熱凝膠含量測定

干重法。取20 mL發酵液于8 000 r/min離心20 min，向離心得到的沉淀中添加1 mol/L的NaOH溶液20 mL并振蕩3 h，使熱凝膠充分溶解，然后離心(8 000 r/min，20 min)取上清液，用 4 mol/L HCl調pH至中性，得到半透明的凝膠，再離心(8 000 r/min，20 min)，向沉淀中加蒸餾水洗滌離心4次，在80℃烘干至恒重，稱重計算產量。

1.2.4 生物量測定

菌體生長期的生物量用OD600表示。

1.2.5 殘糖測定

高效液相色譜法。取1 mL樣品，在8 000 r/min條件下離心10 min，上清液用高效液相色譜檢測(LC-2010A，日本島津)。色譜柱:Bio-Rad Aminex HPX-87H column，300 mm ×7.8 cm;柱溫:35 ℃;流動相:5 mmol/L H2SO4;流速:0.6 mL/min;檢測器:示差折光檢測器;進樣量:2 μL。

1.2.6 殘余氯化銨含量測定

水楊酸鈉-次氯酸鈉比色法［13］。

1.2.7 exoR基因片段的克隆及序列分析

根據NCBI中 Agrobacterium sp.ATCC 31749(以下簡稱ATCC 31749)exoR基因序列，設計特異性引物exoR-F/R，實驗所涉及引物都如表1所示;以ATCC 31749基因組DNA為模板進行PCR擴增。PCR擴增產物經PCR產物純化回收試劑盒純化回收后用于下一步試驗。

1.2.8 自殺重組質粒pJQ-exoR-kan的構建

利用自殺質粒pJQ200KS進行exoR基因插入突變［14］。將回收純化的exoR基因片段連接到pMD-19 Simple T載體上，陽性克隆質粒命名為pMD-exoR，提取質粒進行exoR測序分析。以pKD4質粒上卡那霉素抗性基因(kan)序列為參照和模板，設計引物并擴增kan片段，引物兩端設計有酶切位點Hind III和Kpn I。將回收純化的kan基因片段連接到pMD-19 Simple T載體上，陽性克隆質粒命名為pMD-kan，提取質粒進行kan測序分析。因為exoR基因中間沒有合適的限制性內切酶位點，根據質粒pMD-exoR基因序列設計引物pMD-exoR-F/R，定點突變出Kpn I的酶切位點。陽性克隆質粒命名為突變pMD-exoR，提取質粒進行 exoR測序分析。將pMD-kan和突變pMD-exoR同時進行Hind III和Kpn I雙酶切連接，連接產物轉化JM109宿主菌，采用Amp和Kan雙抗性及PCR篩選陽性克隆，質粒命名為pMD-exoR-kan，此時exoR基因結構被kan片段插入而成功破壞。將質粒pMD-exoR-kan和自殺質粒pJQ200KS同時用Sal I和Sac I進行雙酶切，酶切產物exoR-kan片段和線性pJQ200KS經連接后，轉化 DH5α λpir宿主菌，用含有50 mg/L Kan，50 mg/L Gm的LB平板進行篩選，所得單菌落為連接有exoR-kan片段的陽性克隆。挑取單菌落、培養、提質粒進行PCR和測序驗證，得到本研究所需的自殺重組質粒，命名為pJQ-exoR-kan。

1.2.9 Agrobacterium sp.ATCC 31749 exoR基因缺陷株的構建

采用三親本接合的方法將含有自殺重組質粒的DH5α λpir細胞分別和含有輔助質粒 PRK2013的DH5α細胞以及 ATCC 31749細胞，按1∶1∶2的比例混合，進行接合反應。在含50 mg/L Str，50 mg/L Kan和50 mg/L Gm的ATCC 31749種子培養基上篩選發生重組交換的exoR基因突變株。將交換成功的轉化子培養基稀釋涂布于含5%蔗糖，50 mg/L Str和50 mg/L Kan ATCC 31749平板種子培養基上。挑單菌落進行PCR驗證，exoR-F/R為引物，將只出現2 000 bp大小條帶的菌確定為同源雙交換成功的菌。再經測序最終確定結構被破壞的exoR-kan片段經過同源雙交換整合到ATCC 31749的染色體基因組上，突變株命名為ΔexoR，并進行多代轉接保存用于后續研究。

2 結果與分析

本研究通過構建產胞外多糖負調節子exoR的基因缺陷株，以期強化土壤桿菌合成熱凝膠的過程。

2.1 exoR基因的擴增及序列分析

從土壤桿菌ATCC 31749中PCR擴增得到的exoR基因片段，連接克隆載體pMD-19 Simple T后進行測序分析，exoR基因片段大小為1 245bp。將測序結果在NCBI中比對其DNA序列與Agrobacterium sp.ATCC 31749染色體基因組上exoR基因序列有100%的一致性。確認了所克隆的基因片段的正確性。

2.2 exoR突變菌株的構建

通過三親接合的方法將自殺性質粒pJQ-exoR-kan整合到野生型菌株染色體上，獲得exoR基因的突變菌株，隨后通過菌體抗生素抗性和PCR擴增驗證了該突變株中exoR基因突變的正確性。抗性篩選結果表明突變株能在50 mg/L Kan平板上生長，而野生株則不能。結果表明，從exoR突變株中擴增到了預期大小的exoR-kan片段，而從野生菌株中只能擴增到exoR片段(如圖1所示)。最后將擴增得到的exoR-kan進行測序分析，以上三方面結果均證明自殺性質粒整合到了基因組DNA上，exoR基因結構被成功敲除。

圖1 PCR產物的凝膠電泳Fig.1 Gel electrophoresis of the PCR products

2.3 土壤桿菌ATCC 31749野生型和ΔexoR突變株的生長特性比較

通過搖瓶發酵實驗，分析比較了突變株相對于野生菌株在菌體生長期生物量、氯化銨含量之間的差別，結果如圖2所示。

圖2 野生菌株與ΔexoR突變株生長特性的比較Fig.2 Comparison of growth characteristics between wild type strain and ΔexoR mutant

氮源主要用于構建菌體細胞物質和含氮代謝物，熱凝膠合成過程是典型的非生長耦聯型過程，氯化銨耗盡意味著培養體系中氮源處于嚴格限制狀態，菌體停止生長繁殖，這一條件是熱凝膠開始合成的先決條件。本實驗室在前期研究中發現不同初始氮源濃度將影響菌體生物量的積累，進而影響熱凝膠的合成速率［8］。ΔexoR突變株消耗氯化銨的速度低于野生菌株，但是在發酵16 h時，氯化銨都耗盡了，菌株進入產膠期。突變株的生物量積累量始終低于野生菌株。突變株積累的生物量比野生菌株低了10.11%。盡管消耗相同量的氯化銨，但是突變株的生物量對氯化銨的得率降低了。

2.4 ΔexoR突變株對細菌微莢膜的影響

莢膜是細胞外包圍的一層黏液性物質，由多糖和糖蛋白的多聚體組成，在細胞表面，保護細胞使其免受外部環境的傷害。厚度小于0.2 μm的稱為微莢膜。在暗色背景下莢膜呈透明狀環繞菌體［15］。在熱凝膠發酵生產過程中，Agrobacterium sp.ATCC 31749在菌體生長期沒有熱凝膠合成，這是因為營養條件限制是誘發熱凝膠合成的必要條件，而通常氮源是菌體生長和熱凝膠合成解耦聯的關鍵因素。當氮源充足，菌體只進行生物量的積累;而在氮源耗盡時，菌體停止生長并開始合成熱凝膠。我們對處于生長期的細菌做了透射電子顯微鏡觀察，如圖3，ΔexoR突變株細胞外圍的亮色條帶明顯比野生菌株暗。說明exoR基因的缺失引起細胞非熱凝膠胞外多糖合成的減少，進而節省碳源用于其它物質的合成。

2.5 野生型和ΔexoR突變株的葡萄糖消耗和熱凝膠產量特性的比較

圖3 在細胞生長期時野生菌株與ΔexoR突變株微莢膜的比較Fig.3 Comparison of microcapsule between wild type strain and ΔexoR mutant during cell growth phase

土壤桿菌31749合成熱凝膠過程中需要消耗大量能量物質。熱凝膠合成的前體物質UDP-葡萄糖(UDPG)由一分子UTP脫去一分子的磷元素后和一分子葡萄糖共價結合形成。在熱凝膠合成過程中，UDPG連續的將葡萄糖單元轉移到糖鏈上，最終聚合形成熱凝膠。這個過程需要不斷的消耗葡萄糖［16］。由圖4可知，在發酵31 h后ΔexoR突變株利用葡萄糖的速率相對野生菌株開始加快。一定時間內菌體消耗用于維持自身代謝的葡萄糖的量是一定的，葡萄糖攝取速率的增加，熱凝膠多糖的底物轉化率也會增加，說明突變株可能會產生更多的熱凝膠。

圖4 野生菌株與ΔexoR突變株葡萄糖消耗和熱凝膠產量的比較Fig.4 Comparison of residual glucose and curdlan production between wild type strain and ΔexoR mutant

2.6 野生型和ΔexoR突變株的產膠特性的比較

表2對土壤桿菌ATCC 31749發酵產熱凝膠結果進行了分析。

表2 野生型和ΔexoR突變株的產膠特性的比較Table 2 Comparison of curdlanproduction characteristics between wild type strain and ΔexoR mutant

發酵結束時(72 h)，盡管葡萄糖消耗量相近，但ΔexoR缺失株熱凝膠產量比野生菌株的熱凝膠產量提高了16.8%，產物對碳源轉化率由0.51上升到0.61，提高了 19.6%，熱凝膠生產強度提高了16.7%。在土壤桿菌合成熱凝膠過程中，菌體消耗碳源主要用于菌體生長、熱凝膠合成、釋放有機酸和CO2等副產物，以及代謝維持所需的能量耗散。從2.3節和2.4節中可以看出，ΔexoR缺失株和野生株碳源消耗量非常接近，ΔexoR缺失株的生物量有所減少，但熱凝膠的碳源轉化效率明顯提高。已知exoR是一類產胞外多糖的負調節因子［10］，ΔexoR缺失導致胞內熱凝膠合成代謝的負調節因子得到解除，因此使熱凝膠的合成效率得到了提高，而用于合成代謝副產物和能量耗散的碳源消耗減少，碳元素代謝向熱凝膠合成的途徑遷移。實驗室前期研究表明熱凝膠的理論得率系數是0.74［17］，相比野生菌，ΔexoR缺失株發酵得到熱凝膠的得率系數有明顯提高，更接近于理論得率系數。在實驗過程中，ΔexoR缺失株和野生菌株的培養條件相同，僅僅是exoR基因發生了缺失，因此有理由推斷是該基因參與了調控熱凝膠的合成。

3 結論

土壤桿菌ATCC 31749是胞外多糖——熱凝膠的生產菌株，與許多胞外聚合物的生物合成過程類似，氮源限制也是開啟土壤桿菌合成熱凝膠的關鍵控制因素。胞外多糖熱凝膠的合成是一個復雜的過程，需要一系列基因參與，近年來，越來越多的土壤桿菌中胞外多糖合成相關基因被鑒定［18］。本研究構建了exoR基因缺失株，發現該基因缺失株的熱凝膠合成量和底物轉化率增加，參與調控熱凝膠的合成。說明exoR基因的缺失能強化土壤桿菌ATCC 31749合成熱凝膠的過程。但本文僅對exoR基因功能做了初步探究，進一步的研究在本實驗室仍在繼續開展。

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