高產(chǎn)角蛋白酶菌株的篩選、鑒定及其應(yīng)用研究

陳宇浩　張軍儒　徐松鶴

摘要：本實(shí)驗(yàn)以烏蘭察布市周邊各處土壤為樣品，篩選出三株具有高效產(chǎn)角蛋白能力的菌株，并進(jìn)行了形態(tài)學(xué)、生理生化特性分析和 降解羽毛、兔皮脫毛的比較實(shí)驗(yàn)，其中ZY4菌株產(chǎn)酶活力最高，降解羽毛速度最快。

關(guān)鍵詞：角蛋白酶；分離篩選；羽毛降解；皮革脫毛

角蛋白（keratin）是一類纖維硬蛋白，具有穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)和較高的機(jī)械強(qiáng)度，廣泛的存在于毛發(fā)、鱗羽、蹄角、爪喙及其他的表皮結(jié)構(gòu)中，含有較多的二硫鍵，通過交聯(lián)作用使其具有了穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，一般的蛋白酶（如胰蛋白酶和胃蛋白酶等）無法將其降解[1]。

角蛋白酶（Keratinase）是一類可以特異性降解天然角蛋白的蛋白酶類，主要由細(xì)菌、真菌、放線菌產(chǎn)生，大部分為胞外酶。不同種的微生物產(chǎn)生的角蛋白酶性質(zhì)不同，催化角蛋白分解的機(jī)制也有區(qū)別[2]。角蛋白酶具有很高的利用價(jià)值，可以廣泛的應(yīng)用在飼料的生產(chǎn)、皮革的脫毛等各類工業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境治理方面。

內(nèi)蒙古烏蘭察布市被譽(yù)為“草原皮都”，有大量的皮革制品生產(chǎn)銷售，需要發(fā)展新型的生物酶脫毛技術(shù)來減少污染的排放，同時(shí)烏蘭察布市卓資縣的熏雞產(chǎn)業(yè)發(fā)達(dá)，家禽屠宰數(shù)量極大，產(chǎn)生的大量羽毛垃圾需要合理分解。

目前國內(nèi)對(duì)于角蛋白酶產(chǎn)生菌的研究多集中于不同地區(qū)高產(chǎn)角蛋白酶菌株的篩選和鑒定，本文旨在從內(nèi)蒙古烏蘭察布市及周邊區(qū)域篩選出幾株高產(chǎn)角蛋白酶的菌株，可以高效的降解角蛋白，從而為烏蘭察布市廢棄羽毛的利用和皮革脫毛等角蛋白相關(guān)工業(yè)的生產(chǎn)奠定良好的基礎(chǔ)[3]。

1.材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基（g/L）：磷酸二氫鉀15g，羽毛粉5g。

初篩培養(yǎng)基（固體）

酪蛋白培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏8g，酵母浸粉2g，蛋白胨5g，NaCl 2g，瓊脂20g，磷酸氫二鉀18g，干酪素 5g。

脫脂乳粉培養(yǎng)基（g/L）：脫脂奶粉 5g，瓊脂粉 20g，二者需分開滅菌。

羽毛粉篩選培養(yǎng)基（g/L）：自制羽毛粉75g，磷酸氫二鉀1g，酵母膏1g，瓊脂20g，pH75。

兔毛粉篩選培養(yǎng)基（g/L）：兔毛粉5g，磷酸氫二鉀1g，NaCl0g，瓊脂20g。

NA培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏5g，蛋白胨10g，Nacl 5g。

1.2 樣品采集

烏蘭察布市卓資縣家禽屠宰場(chǎng)周圍的羽毛堆積處，集寧師范學(xué)院植物園兔籠周邊兔毛堆積處，烏蘭察布市前旗幸福村羊圈周邊羊毛垃圾堆處分別采集土樣。

1.3菌種的篩選及鑒定

1.3.1初篩：取5g土樣接入100ml生理鹽水中，80℃水浴15min。接種于富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，涂布于干酪素初篩平板培養(yǎng)基，將出現(xiàn)透明圈的單菌落接種于其他種類篩選平板上進(jìn)行二次篩選，最終挑選在各類平板上均能產(chǎn)生透明圈的菌株編號(hào)保藏。

1.3.2復(fù)篩：將初篩得到的菌株分別接種到NA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，測(cè)定各菌株角蛋白酶活性，取酶活性較高的三株菌種分別保存。

1.3.3酶活性測(cè)定：角蛋白酶活性的測(cè)定參考Gradisar等的方法，以羽毛粉為反應(yīng)底物，三氯乙酸為催化反應(yīng)終止劑。于280nm處測(cè)定反應(yīng)液的吸光度。

1.3.4酶活性單位定義：在上述反應(yīng)條件下，測(cè)得的D280nm值每升高001所需要的酶量定義為 1個(gè)酶活單位（U）。

1.3.5菌種鑒定

分別觀察三株菌株的菌落形態(tài)特征，同時(shí)觀察革蘭氏染色特征，生理生化鑒定參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》。

1.4高產(chǎn)蛋白酶菌株的羽毛分解實(shí)驗(yàn)

將三株菌株，以相同的接種量加到放有一只完整羽毛的NA培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)，在不同的時(shí)間點(diǎn)觀察不同菌株對(duì)羽毛的降解程度[6]。

1.5高產(chǎn)蛋白酶菌株的兔皮脫毛實(shí)驗(yàn)

取大小相同的兔皮分別放入不同種類菌株的培養(yǎng)液中，以不加酶液的皮樣作為對(duì)照，進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析，觀察脫毛效果。

2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1菌株的篩選

2.1.1菌株的初篩

通過四種蛋白篩選平板的篩選，得到了11株能產(chǎn)生角蛋白酶并在平板有較大透明圈的菌株，分別編號(hào)。

2.1.2菌株的復(fù)篩

以角蛋白酶活性為指標(biāo)進(jìn)行比較，通過復(fù)篩獲得 3株角蛋白酶高產(chǎn)菌編號(hào)分別為ZY2、ZY4、QY1，酶活性分別為587U/mL、643U/mL、532U/mL。

2.2菌株的鑒定

ZY4菌落顏色為白色，質(zhì)地均勻，菌落邊緣規(guī)則，濕潤，微透明，菌落正反面形態(tài)一致，短桿狀菌體，革蘭氏陽性芽孢桿菌。QY1菌落呈微黃色，光滑的圓形，質(zhì)地均勻濕潤，邊緣不整齊，革蘭氏陽性桿菌。

2.3高產(chǎn)蛋白酶菌株的羽毛分解實(shí)驗(yàn)

三株菌對(duì)羽毛均有降解作用，ZY4菌株作用5天以后其中的羽毛只剩下硬桿，8天后完全降解，降解羽毛的速率最快。

2.4高產(chǎn)蛋白酶菌株的兔皮脫毛實(shí)驗(yàn)

QY1菌株作用24h的兔皮脫毛速率最快，表皮脫落后，裸皮粒紋比較清晰。

3.結(jié)論

從不同來源的土壤中分離出了3株高產(chǎn)角蛋白酶菌株，綜合分析其中ZY4菌株產(chǎn)酶活力最高，降解羽毛速度最快，QY1菌株作用于兔皮脫毛效果最好，本研究表明ZY2、ZY4、QY1是具有高效產(chǎn)角蛋白酶能力的菌株，其16S rDNA分析和工業(yè)化的應(yīng)用有待于深入研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]楊建強(qiáng)，湯國營.角蛋白酶研究發(fā)展[J].生物技術(shù)通訊.2005.16（2）：37-42

[2]蔡成崗，鄭曉冬.角蛋白酶的來源、理化性質(zhì)與生物工程研究進(jìn)展[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32（4）：111-114.

[3]王政，郭士兵，姚大偉，等.高效降解角蛋白菌株的分離篩選與鑒定