固定化磷脂酶A1催化制備DHA型磷脂

馬彥慶 陳斌斌 鄭 妍 修志龍 楊天奎 牟 英

（大連理工大學生命科學與技術學院1，大連 116000）（豐益（上海）生物技術研發中心有限公司2，上海 200000）

固定化磷脂酶A1催化制備DHA型磷脂

馬彥慶1陳斌斌2鄭 妍2修志龍1楊天奎2牟 英1

（大連理工大學生命科學與技術學院1，大連 116000）（豐益（上海）生物技術研發中心有限公司2，上海 200000）

以磷脂酰膽堿（PC）富集物和二十二碳六烯酸（DHA）濃縮液為底物，正己烷為反應介質，在固定化磷脂酶A1（PLA1）的催化作用下，制備DHA型磷脂（PL－DHA）。研究了底物摩爾比、加酶量、溶劑用量、反應溫度、水活度、反應時間對PL－DHA制備的影響。通過條件優化，確定最佳條件為：DHA濃縮液和PC的摩爾比為4∶1，加酶量為2種底物總質量的20%，溶劑用量為4 mL，反應溫度為40℃，反應時間為2 h。經氣相色譜定量分析，得到的磷脂中DHA的含量為17.7mg／g PL，并用棒狀薄層色譜火焰離子檢測器（TLC－FID）分析了PC含量隨反應的變化。

磷脂酰膽堿 二十二碳六烯酸 固定化磷脂酶A1

磷脂（PL）是生物膜重要組成部分，而且在細胞各種活性上起著重要作用，作為常用乳化劑和抗氧化劑，磷脂在食品、化妝品及醫藥行業也有廣泛應用［1］。近年來，DHA因其具有促進嬰幼兒智力發育，提高認知力及免疫力［2］等特性成為研究熱點。研究表明，DHA生理功能因其載體分子形式不同而有所差異，因此人們開始重視DHA與磷脂的雙重作用。大量試驗表明磷脂型DHA比甘三酯型DHA更有利于DHA吸收［3］，可以更快速地為大腦皮層提供所需DHA［4］等。

由于從海產品中分離、富集DHA型磷脂比較復雜，且有產地及原料限制，其產量無法滿足人們需求，需要利用其他方法進行制備［5］。DHA型磷脂的制備方法有化學法與酶法，化學法因催化劑非專一性和試劑毒性，會造成副產物多且影響產品安全性。酶法則具備較多優勢：首先，酶具有位置特異性，既可以選擇磷脂特定位點進行催化反應，也可以選擇性地催化特定底物，副產物少，產品安全性好；其次，酶法反應條件溫和，具有環境友好的優點［6］。近些年來不斷有研究者嘗試采用酶法制備DHA型磷脂［7－8］。本研究報道固定化PLA1催化酸解反應制備DHA型磷脂。

1 材料和方法

1.1 材料與方法

1.1.1 原料與試劑

濃縮磷脂：秦皇島金海食品工業有限公司，主要組分質量分數為：磷脂酰乙醇胺（PE）11.96%、磷脂酰肌醇（PI）8.86%、磷脂酰膽堿（PC）11.34%、溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）2.71%；藻油：廈門匯盛生物有限公司，其中DHA質量分數≥35%；磷脂酶A1酶液：諾維信公司。

1.1.2 儀器

Agilent7820A氣相色譜儀：美國Agilent Technologies有限公司；IATROSCAN MK－6S TLC－FID：日本三菱雅特隆（IATRON）公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 PC的富集

參考張秀青等［9］的方法，對濃縮磷脂中的PC進行富集，得到PC提取物經高效液相色譜定量檢測，其中PC 59.4%、PE 19.91%、溶血磷脂酰膽堿（LPC）1.62%。經由氣相色譜檢測PC脂肪酸組成，計算其平均分子質量約為773 u。

1.2.2 DHA的富集

參考Domart等［10］的方法，富集DHA經氣相色譜檢測純度為95.49%。平均分子質量約為320 u。

1.2.3 固定化PLA1的制備

按照2∶1∶1（g∶mL∶mL）比例分別添加牌號為D380的堿性離子交換樹脂、磷脂酶A1酶液及20 mmol／L（pH 5.5）磷酸鹽緩沖液，在30℃搖床中以100 r／min的轉速振蕩6 h，然后于30℃真空干燥箱內干燥至水分為2.5%。

1.2.4 酸解反應

取200mg PC，按比例加入DHA濃縮液，然后按照設定加入正己烷，底物溶解后，加入定量固定化PLA1，充氮保護，反應完成后分離固定化酶，終止反應。

反應過程中搖床的轉速均為250 r／min。

1.2.5 產物的分離

反應完成后回收反應液，并以正己烷洗滌固定化酶3次，將洗滌液與反應液合并，低溫旋蒸除去溶劑得粗產品。然后用冷丙酮將粗產品脫油3次，離心后收集沉淀層，然后低溫真空干燥。

1.2.6 磷脂中DHA含量的分析

1.2.6.1 磷脂的甲酯化

稱取一定質量樣品，溶于正己烷，以C13∶0甲酯為內標物，參考Seung等［11］方法進行甲酯化后，備氣相色譜定量分析。以下數據中DHA含量均為磷脂產物中含有DHA的質量含量。

1.2.6.2 氣相色譜的條件

檢測器：氫火焰離子化檢測器。色譜柱型號為：CP－Sil 88 50 m×0.25 mm（0.2μm）。毛細管柱柱壓：14.84 psi。進樣量：1μL。分流比：20∶1。進樣口溫度：250℃。柱溫箱升溫程序為：80℃保持2 min，以10℃／min的速率升高至120℃，然后以5℃／min的速率升高至180℃后保持2 min，再以2℃／min的速率升高至206℃，之后以25℃／min的速率升高至230℃后保持5 min，最后運行2 min。

1.2.7 磷脂中PC含量檢測

1.2.7.1 TLC－FID掃描條件

稱取一定質量的樣品，加入甲醇∶乙醇（體積比）＝1∶1溶液溶解。色譜柱型號為：CHROMAROD－SIII。掃描速度：30 s／根。展開劑配比（體積比）為：氯仿∶甲醇∶水＝72∶31∶3.2。檢測器為FID檢測器，氫氣流速為160 mL／min，空氣流量為2 L／min。

1.2.7.2 PC濃度與TLC－FID中PC出峰面積的標準曲線的建立

取PC標樣，溶解于氯仿中，然后進行梯度稀釋，分別配制成不同濃度標準溶液。分別將標準溶液上樣，得到標準曲線為：

Y＝0.000 2－1.022 9，其中R2＝0.990 4。

式中：Y為PC濃度／mg／mL；為峰面積。

1.2.7.3 PC含量的計算

由1.2.7.1所述條件對樣品進行掃描，然后根據1.2.7.2公式得到溶液的濃度，最后根據如下公式計算得到樣品中PC含量：

PC＝VY／M×100%

式中：V為溶液體積／mL；Y為樣品濃度／mg／mL；M為稱樣質量／mg。

2 結果與討論

在預試驗中，分別選取正己烷、甲苯、叔丁醇作為反應溶劑，以商品NOVOZYM 435酶、TL IM酶、固定化PLA1作為催化劑，發現固定化PLA1在正己烷體系中的反應較優，磷脂產物中DHA含量較高，所以采用固定化PLA1作為催化劑，正己烷為溶劑進行反應優化。

2.1 底物比對反應的影響

在反應溫度為40℃、加酶量為底物總質量15%、溶劑用量為5 mL、反應時間為2 h條件下，考察DHA∶PC／mol∶mol對反應的影響，結果見圖1。

圖1 底物比對反應的影響

由圖1可知，隨著底物比由2∶1升高至4∶1，DHA含量有所增加，但是隨著底物比繼續增加，DHA含量開始減少，同時PC水解也逐漸嚴重，原因可能是DHA濃縮液中含有一定水分，隨著DHA添加量增加，累積的水分造成PC水解。在此條件優化中，DHA含量在底物比4∶1處達到最大值，所以選擇底物比為4∶1繼續優化反應溫度。

2.2 反應溫度對反應的影響

在底物比為4∶1、加酶量為底物總質量15%、溶劑用量為5 mL、反應時間為2 h條件下，考察反應溫度對反應的影響，結果見圖2。

圖2 反應溫度對反應的影響

由圖2可知，隨著溫度由35℃升高至40℃，DHA含量有所增加，當溫度繼續升高時，DHA含量開始減少，這是因為，一定范圍內提高反應溫度雖然可提高底物傳導速率，增強酶活力，加快反應速度，但是高溫會使酶發生熱變性［13］。在溫度低于40℃時，酶活力增強，底物傳導速率加快，有利于反應進行。然而超過這一溫度時，溫度過高引起酶的熱變性。另一方面，隨著溫度升高，PC水解逐漸變得嚴重，可知在考察溫度范圍內，溫度升高不利于產物回收。DHA含量在溫度為40℃時處于最大值，所以選擇此溫度繼續優化加酶量。

2.3 加酶量對反應的影響

在反應溫度為40℃、底物比為4∶1、溶劑用量為5 mL、反應時間為2 h條件下，考察加酶量對反應的影響，結果見圖3。

圖3 加酶量對反應的影響

由圖3可知，當加酶量由10%增加至25%時，DHA含量逐漸增加，但是當加酶量繼續增加時，DHA含量卻開始減少。原因可能是當加酶量較少時，反應開始底物未被酶飽和，隨著加酶量增加，底物逐漸被酶飽和，反應速度隨之加快，但加酶量過多，會對底物傳導產生阻礙作用，使反應速度降低。當加酶量為20%與25%時，DHA含量最高，考慮20%的加酶量更適合實際生產需要，所以選擇此加酶量繼續優化溶劑用量。

2.4 溶劑用量對反應的影響

在反應溫度為40℃、底物比為4∶1、加酶量為底物總質量20%、反應時間2 h條件下，考察溶劑用量對反應的影響，結果見圖4。由圖4可知，當正己烷用量由7 mL減少至6 mL時，DHA含量有所增加，溶劑用量繼續減少，DHA含量基本不再變化。這是因為根據酶反應動力學的米氏方程，當底物濃度較小時，底物濃度越大，反應速度越快，而當底物濃度繼續增加時，反應速度則不會出現明顯變化。在溶劑用量為4 mL時，DHA含量相對較高，而且與6 mL相比，需要溶劑量較少，更適合實際生產需要，所以選此溶劑用量繼續優化水活度。

圖4 溶劑用量對反應的影響

2.5 水活度對反應的影響

在反應溫度為40℃、底物比為4∶1、溶劑用量為4 mL、加酶量為底物總質量20%、反應時間2 h條件下，考察水活度對反應的影響。水活度的控制按照Ducret等［14］描述的方法。

圖5 水活度對反應的影響

由圖5可知，當水活度為0.11時，DHA含量較小，這是因為酶活力需要一定的水活度來保持［15］，而此水活度過低，酶活力較差。隨著水活度增加至0.33，酶活力增加，DHA含量隨之有所升高，但當水活度繼續增大，DHA含量開始減少，而且PC的水解也變得更為嚴重。當體系水分較高時，作為副反應的水解反應將成為主要反應。所選用4個水活度的反應結果與未平衡水活度的反應結果作比較發現，未平衡水活度的反應較優，推測此時水活度應該在0.11與0.33之間，選擇此水活度繼續優化反應時間。

2.6 反應時間對反應的影響

在反應溫度為40℃、底物比為4∶1、溶劑用量為4 mL、加酶量為底物總質量20%條件下，考察反應時間對反應的影響。

圖6 反應時間對反應的影響

由圖6可以看出，當反應時間由1.0 h增加至2.0 h時，DHA含量有所增加，反應時間繼續增加，DHA含量基本不變。這是因為在反應進行至2.0 h時，已達到平衡點，隨著反應時間繼續增加，反應體系中各種物質的質量不會發生變化。

3 結論

本試驗研究了利用固定化PLA1催化富含PC的磷脂進行酸解反應從而得到DHA型磷脂的方法。由試驗的優化，當磷脂用量為200mg時，得到的最優酸解反應條件為：DHA濃縮液和PC的摩爾比為4∶1，加酶量為2種底物總質量的20%，溶劑用量為4 mL，反應溫度為40℃，反應時間為2.0 h。

［1］James F M，Roslyn B A，David R H，et al.Lipids.In：Chemistry，biochemistry and nutrition［M］.New York：Plenum Press，1986：369－428

［2］Tapiero H，Nguyen B G，Couvreur P，et al.Polyunsaturated fatty acids（PUFA）and eicosanoids in human health and pathologies［J］.Biomed Pharmacother，2002，56（5）：215－222

［3］Ulven SM，Kirkhus B，Larnglsit A，et al.Metabolic effects of Krill oil are essentially to those of fish oil butat lower dose of EPA and DHA，in healthy volunteers［J］.Lipids，2011，46（1）：37－46

［4］Picq M，Chen P，Perez M，et al.DHA metabolism：targeting the brain and lipoxygenation［J］.Molecular Neurobiology 2010，42（1）：48－51

［5］孫兆敏，李金章，叢海花，等.酶法制備n－3多不飽和脂肪酸型磷脂的工藝［J］.中國油脂，2010，35（4）：33－36

［6］Hong S I，Kim Y，Kim C，et al.Enzymatic synthesis of lysophosphatidylcholine containing CLA from sn－glycero－3－phosphatidylcholine（GPC）under vacuum［J］.Food Chemistry，2011，129（1）：1－6

［7］潘麗，谷克仁，楊壯.制備富含n－3多不飽和脂肪酸的磷脂［J］.糧油加工，2006，12：57－60，68

［8］Garc IA H S，Kim I－H，Lope I－HernandeiA，etal.Enrichment of lecithin with n－3 fatty acids by acidolysis using immobilized phospholipase A1［J］.Grasas Y Aceites，2008，59（4）：368－374

［9］張秀青，于才淵.高純卵磷脂的分離提純方法［J］.糧油加工，2006，4（4）：45－49

［10］Domart C，MiyauchiD T，SumerwellW N.The fractionation ofmarine－oil fatty acid with urea［J］.The Journal of the A-merican Oil Chemists'Society，1995，32（9）：481－483

［11］Seung IH，Yangha K，Chong－Tai K，et al.Enzymatic synthesis of lysophatidylcholine containing CLA from snglycero－3－phosphatidylchoine under vacuum［J］.Food Chemistry，2011，129（1）：1－6

［12］GB／T 17377—2008，動植物油脂脂肪酸甲酯的氣相色譜分析［S］

［13］陳惠晴，楊基礎.超臨界CO2中脂肪酶催化反應的研究［J］.清華大學學報，1999（6）：28－30

［14］Ducret A，TraniM，Lortie R.Lipase－catalyzed enantioselective esterification of ibuprofen in organic solvents under controlled water activity［J］.Enzyme and Microbial Technology，1998，22（4）：212－216

［15］Rao H V，Peter JH，Alasdair RM.Reaction ratewith suspended lipase catalyst shows similar dependence on water activity in different organic solvents［J］.Biochimica et Biophysica Acta，1992，1118（3）：218－222.

Preparation of Phospholipid－Docosahexaenoic Acid Catalyzed by Immobilized Phospholipase A1

Ma Yanqing1Chen Binbin2Zheng Yan2Xiu Zhilong1Yang Tiankui2Mu Ying1
（School of Life Science and Biotechnology，Dalian University of Technology1，Dalian 116000）
（Functional Food Technology Department，Wilmar（Shanghai）Biotechnology Research and Development Center Company Limited2，Shanghai 200000）

A facile enzymatic synthesis approaching to prepare phospholipid－docosahexaenoic acid（PLDHA）has been investigated through the phospholipase A1（PLA1）－catalyzed reaction of docosahexaenoic acid（DHA）aswell as phospholipid enriched in phosphatidylcholine（PC）.The alteration elements of different parameters such asmolar ratio of substrates，reaction temperature，enzyme dosage，solvent dosage，water activity and reaction time have been researched systematically.The ratio of DHA and PCwas4∶1（mol／mol），the enzyme dosagewas the 20%of two substrates，the solvent dosagewas4mL and the reaction temperature and reaction time were 40℃and 2 h. By the quantitative analysis of GC，the content of DHA was detected to be 17.7mg／g PL on the optimal condition. The variation of PC content before and after the reaction was also analyzed by The Thin Layer Chromatography－Flame Ion Detector（TLC－FID）.

phosphatidylcholine，docosahexaenoic acid，immobilized phospholipase A1

TS229

A

1003－0174（2015）03－0075－05

2013－11－28

馬彥慶，男，1988年出生，碩士，生物化工

修志龍，男，1965年出生，教授，生物化工