固定化金屬親和層析富集麥胚蛋白金屬螯合肽的研究

王曉萍 郭曉娜 朱科學 彭 偉 周惠明

（江南大學食品學院，無錫 214122）

固定化金屬親和層析富集麥胚蛋白金屬螯合肽的研究

王曉萍 郭曉娜 朱科學 彭 偉 周惠明

（江南大學食品學院，無錫 214122）

利用3種蛋白酶（堿性蛋白酶Alcalase 2.4L、風味蛋白酶Flavourzyme 500MG和木瓜蛋白酶Papain）分別對麥胚蛋白進行酶解，篩選金屬螯合率最高的酶解產物，再利用固定化金屬親和層析富集金屬螯合肽，并分析金屬螯合肽的相對分子質量分布和氨基酸組成。結果表明：在Alcalase 2.4L的酶解作用下，酶解時間200 min時，酶解產物的金屬螯合率達到最大值（69.62±0.96）%。以此麥胚蛋白酶解物通過固定化金屬離子親和層析富集得到的組分，相對分子質量集中在180～2 000，谷氨酸（Glu）和天冬氨酸（Asp）的含量分別高達（22.64±1.50）%和（14.93±0.24）%。

麥胚蛋白 金屬螯合肽 固定化金屬親和層析 相對分子質量 氨基酸組成

金屬螯合肽是指對Zn2＋、Fe2＋、Ca2＋等金屬離子具有螯合作用的生物活性肽。金屬螯合肽能作為運輸鈣、鐵、鋅等微量元素的載體，提高微量元素的腸吸收效率和生物利用率。研究者已分別從鱭魚肌肉［1］、芝麻［2］、和羅非魚［3］等來源的蛋白酶解產物中分離出鐵、鋅和鈣螯合肽等。

小麥胚芽作為小麥粉加工的副產物，含有30%左右的蛋白質，且氨基酸分布均衡，人體必需的8種氨基酸含量占總氨基酸的34.7%，是潛在的優質植物蛋白資源［4］。近年來，以麥胚蛋白為原料制備抗氧化肽［5］和抗緊張素抑制酶肽［6］等生物活性肽的研究得到了廣泛關注。然而，利用麥胚蛋白分離制備金屬螯合肽的研究鮮見報道。

固定化金屬離子親和層析（Immobilized Metal Ion Affinity，IMAC）是一種新型的分離技術，廣泛用于蛋白質和肽的分離［7］。此方法利用蛋白質或肽段表面的氨基酸與固定化金屬離子的親和力的不同來實現特異性分離。因此，本研究采用固定化金屬離子親和層析富集麥胚蛋白源金屬螯合肽，并分析金屬螯合肽的相對分子質量分布與氨基酸組成，為金屬螯合肽的螯合機理提供借鑒，同時對深度開發和利用麥胚蛋白，提高人民膳食營養與健康水平，具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂麥胚（蛋白質：36.84%；脂肪：1.12%；水分：9.04%）：河南安陽漫天雪有限公司；殼聚糖（脫乙酰度＞90%）：無錫華盛環保科技有限公司；Alcalase 2.4L，Flavourzyme 500MG，Papain：諾維信（中國）生物技術有限公司；Ferrozine，亞氨基二乙酸二鈉（IDA）：美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 試驗儀器

KS－900脈沖式超聲波細胞粉碎機：寧波海曙科生儀器廠；CR 21GIII型高速冷凍離心機：HITACHI（日本）公司；冷凍干燥機：LABCONCO（美國）公司；HD－5電腦紫外檢測儀、BS－100A自動收集器、DHL－B電腦數顯恒流泵：滬西（上海）分析儀器廠；T6新世紀紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；Waters 600高效液相色譜儀：Waters（美國）公司；Agilentl100氨基酸分析儀：Agilent（美國）公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 脫脂麥胚中蛋白質的提取

稱取一定質量的脫脂麥胚粉溶于去離子水（10%，m／V），用1 mol／L NaOH溶液調節pH值至9.0，置于超聲波細胞粉碎機攪拌（低頻，30℃，30 min），離心（3 500 r／min，30 min），將離心所得沉淀重復上述超聲波輔助堿溶過程，合并2次上清液。用1 mol／L HCl溶液調節上清液pH值至4.0，充分攪拌，離心（3 500 r／min，30 min），棄去上清液收集沉淀。用60%乙醇溶液洗滌沉淀3次，離心（3 500 r／min，30 min），取沉淀，冷凍干燥后得麥胚蛋白粉，置于干燥器中備用。

1.3.2 脫脂麥胚蛋白酶解物的制備

稱取一定質量麥胚蛋白粉，用去離子水調配成5%（m／V）的懸浮液，加入蛋白酶并于其最適條件下酶解一段時間，反應過程采用1 mol／L NaOH溶液維持體系pH值恒定。酶解反應結束后，沸水中滅酶10 min，冰水冷卻后離心（4 000 r／min，30 min），收集上清液，微濾除去大分子雜質，冷凍干燥得麥胚蛋白酶解物。各種酶的作用條件見表1。

表1 各酶的作用條件

1.3.3 金屬螯合率的測定

取5 mL樣品溶液（1mg／mL），加入2 mmol／L FeSO4·7H2O溶液100μL和5 mmol／L ferrozine溶液200μL，于漩渦振蕩器上振蕩反應10 min，在562 nm下測定吸光值。空白以去離子水代替樣品。吸光值越低，表示金屬螯合能力越強。

金屬螯合率＝（1－A1／A0）×100%

式中：A1為樣品的吸光值；A0為空白的吸光值。

1.3.4 金屬螯合親和層析柱的制備

按照Shi等［8］方法制備IDA－殼聚糖填料。將制備好的IDA－殼聚糖填料裝柱（1.6 cm×30 cm），用雙蒸水流洗3個柱體積，接著用0.1 mol／L的Zn-SO4·7H2O溶液流洗4個柱體積，使填料充分吸附Zn2＋，再用雙蒸水洗去未結合的Zn2＋，得到Zn2＋－IDA－殼聚糖填料。用磷酸緩沖液（0.05 mol／L，pH 6.0）平衡金屬螯合親和層析柱，備用。

1.3.5 金屬螯合肽的富集

將麥胚蛋白酶解物（WGPH）用磷酸緩沖液（0.05 mol／L，pH 6.0）配成10mg／mL溶液，通過金屬螯合親和層析柱。上樣量5 mL，流速1 mL／min，檢測波長220 nm，每5 min收集1管。先以雙蒸水洗去未結合的肽，再用含0.1 mol／L NaCl的磷酸緩沖液（0.1 mol／L，pH 6.0）洗脫出金屬螯合肽。收集各組分，冷凍干燥。

1.3.6 分子質量分布測定

采用高效液相排阻色譜法進行測定。高效液相色譜系統為Waters 600，色譜柱為TSK gel2 000 SWXL（7.8 mm×300 mm），流動相為乙腈／水／三氟乙酸（45／55／0.1），流動相為0.5 mL／min，柱溫30℃，采用紫外二極管陣列檢測器于220 nm波長處檢測。分別采用標準品乙氨酸－乙氨酸－乙氨酸（Mr189）、乙氨酸－乙氨酸－酪氨酸－精氨酸（Mr451）、桿菌酶（Mr1 450）、抑肽酶（Mr6 500）和細胞色素（Mr12 500）進行相對分子質量的校正。

1.3.7 氨基酸組成分析

采用Agilentl100液相色譜法。稱取定量樣品，加入8 mL HCl溶液（6 mol／L），真空封口，在110℃下水解24 h，待冷卻后進行轉移、定容、過濾、抽真空、過夜干燥。通過鄰苯二甲醛（OPA）柱前自動衍生、氯甲酸芴甲酯（FMOC－Cl）與二級氨基酸（脯氨酸，羥脯氨酸）衍生聯用，經高效液相色譜儀分析。樣品的氨基酸組成以色譜峰的保留時間進行定性，以峰面積外標法進行定量。

1.3.8 統計分析

試驗結果以平均數±標準差（Means±SD）形式表示，以方差分析ANOVA來檢測平均值之間的差異，以P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 脫脂麥胚蛋白酶解物的篩選

本試驗選取Alcalase 2.4L、Flavourzyme 500MG和Papain 3種酶，在底物質量濃度為5 g／100 mL，酶與底物比為1%，反應溫度和pH值分別為各種酶的最適條件下進行反應，在不同水解時間取樣測定金屬螯合率，試驗結果如圖1所示。3種麥胚蛋白酶解物均有金屬螯合作用，并隨酶解時間的延長，金屬螯合率有先增大后減小的趨勢。這可能是由于在酶解的前期，隨著酶解時間的延長，越來越多的肽段被釋放出來，金屬螯合率不斷增大；而酶解后期，一些多肽繼續被降解，產生了一些游離氨基酸使金屬螯合率下降的緣故［2］。總的來看，Alcalase 2.4L水解物的金屬螯合率明顯強于Flavourzyme 500MG水解物和Papain水解物（P＜0.05）。酶的專一性使各酶切位點不同，酶解產物多肽的氨基酸組成及排列也不盡相同，這是影響肽的功能特性的主要因素。已有研究表明［9］，堿性蛋白酶對植物蛋白的羧端肽鍵有較強的專一性。Alcalase 2.4L酶解產物的金屬螯合率較其他大，可能與此有關。因此，采用Alcalase 2.4L進行酶解反應，并選擇200 min時的麥胚蛋白酶解產物（WGPH）進行親和分離。

圖1 不同酶解條件下麥胚蛋白酶解物的金屬螯合率

2.2 固定化金屬親和層析分離麥胚蛋白金屬螯合肽

圖2所示為經過分離后得到的未結合的肽（F1）和具有強結合能力的金屬螯合肽（F2）。金屬螯合肽（F2）的金屬螯合率為69.05%，而未結合的肽（F1）的金屬螯合率為－3.81%。此結果表明，固定化金屬親和層析可以有效富集麥胚蛋白金屬螯合肽。Chen等［10］利用固定化金屬親和層析從牡蠣蛋白水解物中分離出鋅結合能力不同的2種鋅螯合肽。因此，固定化金屬親和層析用于分離金屬螯合肽是可行的。

圖2 固定化金屬親和層析分離麥胚蛋白金屬螯合肽的分離譜圖

2.3 相對分子質量分布變化

蛋白質經過酶解可產生分子量不同的肽段，而多肽的生物活性與其肽鏈長度有著密切的關系［11］。已有研究表明，相對分子質量在180～2 000的麥胚多肽比大分子的肽段表現出更強的抗氧化活性［5］。為了進一步探究金屬螯合率與相對分子質量的關系，本試驗采用HPLC法對麥胚蛋白酶解物、金屬螯合肽等組分的相對分子質量分布進行對比分析，結果見表2。經過固定化金屬親和層析分離后，相對于麥胚蛋白酶解物（WGPH），金屬螯合肽（F2）的相對分子質量在500～2 000的比例有所提高，而未結合肽（F1）的相對分子質量在＞2 000的比例大大增加，約為麥胚蛋白酶解物（WGPH）的10倍。比較金屬螯合肽（F2）和未結合肽（F1），在相對分子質量＞2 000的分布范圍內，未結合肽（F1）所占的比例遠大于金屬螯合肽（F2）；而在相對分子質量為180～1 000的分布范圍內，金屬螯合肽（F2）所占的比例卻遠大于未結合肽（F1）。由此可見，相對分子質量太大的肽不容易吸附到固定化金屬親和色譜柱上，金屬螯合肽的相對分子質量集中分布在180～2 000。Liu等［12］通過超濾將不同相對分子質量分布的麥胚蛋白酶解物分開，發現其中＜2 000的組分對鈣離子有很強的螯合性。Chen等［10］等將牡蠣蛋白酶解物通過固定化離子親和色譜、反相高效液相色譜等，分離純化出一條相對分子質量為1 882的多肽，并證實其對鋅離子有較高的結合能力。

表2 相對分子質量分布

2.4 氨基酸組成變化

當蛋白質或肽中富含谷氨酸（Glu）或天冬氨酸（Asp）等氨基酸時，易與金屬離子結合，谷氨酸的γ－COO－和天冬氨酸的β－COO－是蛋白質或肽與金屬離子的結合位點［10，12－13］。由表3可以看出，經固定化金屬親和層析分離后，天冬氨酸（Asp）的質量分數由（7.95±0.17）%提高到（14.93±0.24）%（P＜0.05），谷氨酸的質量分數由（13.67±0.41）%提高到（22.64±1.50）%（P＜0.05）。固定化金屬親和層析高效地富集了含谷氨酸和天冬氨酸的金屬螯合肽。另外，酪氨酸（Tyr）的質量分數由（2.27± 0.01）%提高到（3.56±0.01）%（P＜0.05），酪氨酸（Tyr）殘基磷酸化后，其帶負電荷的磷酸集團可與金屬離子結合［14］。蘇氨酸（Thr）的含量也明顯提高，蘇氨酸（Thr）的羥基通常也被認為是肽或蛋白質與金屬離子的結合位點［1，15］。

從營養學的角度看，經固定化金屬親和層析富集得到的麥胚蛋白金屬螯合肽（F2），必需氨基酸種類齊全，且比例均衡，與WHO／FAO的推薦值較為接近，表明金屬螯合肽（F2）不僅能促進微量元素的吸收，而且具有較高的營養價值和保健作用。金屬螯合肽（F2）中蘇氨酸（Thr）較豐富，如與蘇氨酸（Thr）含量較低的白米、小麥粉制品一起攝入可發揮不同食物蛋白質之間的互補作用，提高蛋白質的營養價值和生物利用率。

表3 氨基酸組成和構成分布

3 結論

通過比較Alcalase 2.4L、Flavourzyme 500MG和Papain 3種酶酶解麥胚蛋白得到的酶解產物的金屬螯合率，得到利用堿性蛋白酶Alcalase 2.4L酶解麥胚蛋白200 min時的酶解產物具有最高金屬螯合率（69.92%）。將此酶解物通過固定化金屬離子親和色譜，可精確且有效地富集金屬螯合肽。對比麥胚蛋白酶解物，麥胚蛋白金屬螯合肽相對分子質量在180～2 000分布范圍的比例有所提高；氨基酸組成中谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）、酪氨酸（Tyr）、蘇氨酸（Thr）等可提供肽與金屬結合位點的氨基酸含量均有不同程度的提高。由此可見，多肽的金屬螯合率與相對分子質量和氨基酸組成有著密切聯系。

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Enrichment of Metal Chelating Peptides from Wheat Germ Protein by Immobilized－Metal Ion
Affinity Chromatography

WangXiaoping GuoXiaona Zhu Kexue Peng Wei Zhou Huiming
（School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122）

Wheat germ protein has been hydrolyzed by three proteases（Alcalase 2.4L，Flavourzyme 500MG and Papain）respectively.The hydrolysateswith highestmetal chelating ability have been injected into immobilizedmetal ion affinity chromatography to enrich metal chelating peptides.The relativemolecularmass distribution and amino acid composition of themetal chelating peptideswere analyzed.The results showed that the hydrolysates could be obtained on condition as Alcalase 2.4L and 200 min，and the highestmetal chelating ability reached（69.62± 0.96）%.The relativemolecularmass ofmetal chelating peptides separated from wheatgerm protein hydrolysateswas concentrated in the range of180～2 000.Besides，themetal chelating peptides had high contentof Glu and Asp with the level of（22.64±1.50）%and（14.93±0.24）%respectively.

wheatgerm protein，metal chelating peptide，immobilized－metal ion affinity chromatography，relativemolecularmass，amino acid composition

TS209

A

1003－0174（2015）

國家自然科學基金（31101384），江蘇省自然科學基金（BK2011041）

2013－11－12

王曉萍，女，1988年出生，碩士，糧食、油脂與植物蛋白工程

朱科學，男，1978年出生，教授，谷物精深加工03－0101－05