重金屬抗性大豆根瘤內生菌的篩選及生物學特性

摘要：對努魯爾虎山脈北麓內蒙古敖漢旗段和河南商丘地區采集大豆[Glycine max （L.） Merr]根瘤進行內生菌的分離純化，對獲得的74株菌株分別進行重金屬（Pb2+、Cu2+、Cr6+、Hg2+）抗性測定，對篩選菌株進行生物學特征研究。結果篩選出4株抗性較強的優良菌株，即SQLD42、SQLD47、SQLD67和SQLD71。對重金屬的抗性大小表現為：Pb2+（5 mmol/L）>Cu2+（1.6 mmol/L）> Cr6+（1.2 mmol/L）>Hg2+（0.075 mmol/L）。篩選的4株菌均來源于努魯爾山北麓的內蒙古敖漢旗段，其抗逆性與宿主植物大豆的生長環境密切相關。

關鍵詞：大豆[Glycine max （L.） Merr]；根瘤內生菌；重金屬抗性；生物學特性；生長環境

中圖分類號：S565.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）22-5569-03

Abstract： Endophytes were isolated from soybean nodules collected from Aohan county of Inner Mongolia in north side regions of Nuluerhu mountain eastern partion and Shangqiu region of Henan for purification. Obtained 74 isolates were tested by heavy metal resistance， and screened strains were performed by biological characteristics study. The results showed that 4 strains with stronger resistance， SQLD42、SQLD47、SQLD67 and SQLD71. Heavy metal resistance was shown as： Pb2+（5 mmol/L）>Cu2+（1.6 mmol/L）> Cr6+（1.2 mmol/L）>Hg2+（0.075 mmol/L）. Screened 4 isolates from Aohan county of Inner Mongolia， their resistance were closely related to growing environment of host plant soybean.

Key words： soybean[Glycine max（L.） Merr]； nodule endophytes； heavy metal resistance； biological characteristics； growing environment

在根瘤菌與豆科植物共生關系過程中，根瘤中定殖著不同內生菌，根瘤內生菌對宿主植物具有廣泛的生物學作用，如促生、防病、內生聯合固氮等[1]。內生菌通過產生次生代謝物質，如抗生素、水解酶類和促生物質等與病原菌競爭作用來防治植物病害有較好的應用前景[2]。近些年，對植物內生菌研究范圍在逐漸擴大，從不同植物豆科植物中分離內生菌，研究其生物學特性及與宿主之間的關系等[3，4]，但目前對大豆[Glycine max （L.） Merr]根瘤內生菌重金屬抗性的研究鮮見報道，本研究通過對比采樣地努魯爾山內蒙古敖漢旗段與河南省商丘市的大豆根瘤內生菌的重金屬抗性，探索地理環境對大豆根瘤內生菌抗性的影響，為收集微生物新資源和開發抗性菌株提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株的分離純化

對從河南商丘地區與內蒙古敖漢旗地區采集的大豆根瘤進行分離，首先用無菌水對根瘤進行清洗，用體積分數為95%的乙醇處理20～30 s，后用3%NaClO對其處理3～5 min，再用無菌水漂洗6～8次，然后壓迫根瘤并在YMA培養基上劃線接種，在培養5～7 d后，經劃線分離后得到純的單菌落，最后接種到YMA斜面上，28 ℃培養3～5 d，4 ℃低溫保藏，總計獲得74株菌株。

1.2 試劑和培養基

重金屬鹽和螯合劑：K2CrO4、CuSO4·5H2O、HgCl2、Pb（NO3）2、NiCl2、EDTA。

YMA培養基[5]：酵母粉3 g，甘露醇10 g，瓊脂粉18 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.1 g，K2HPO4 0.5 g，水1 000 mL，pH 6.8～7.0。

TY液體培養基[5]：胰蛋白胨5 g，酵母粉3 g，CaCl2·2H2O 0.7 g，pH 6.8～7.2，H2O 1 000 mL。

1.3 抗性測定

1.3.1 菌懸液的制備 首先用移液器注射1.5 mL蒸餾水于2 mL離心管中，取出接種培養飽滿菌苔的斜面，刮取適量菌苔于離心管中并振蕩均勻，8 000 r/min離心10 min，棄上清，再加入1.5 mL蒸餾水，繼續重復上述操作一次，制成OD≈1（108 CFU/mL）的菌懸液，備用。

1.3.2 接種 每次吸取0.3 mL菌懸液加入多孔接種器槽內，根據對同一株菌的不同濃度梯度處理，配制多個平板，每次在一個平板內點接20個菌樣，28 ℃培養3～5 d，觀察結果。

1.3.3 重金屬抗性測定 將YMA培養基與銅、鉛、汞、鉻重金屬母液分別濕熱滅菌，滅菌后混合均勻，加入0.5 mmol/L EDTA，使Cu2+最終濃度為0.15、0.50、0.90、1.20、1.60和1.80 mmol/L；Hg2+最終濃度為0.025、0.05、0.075和0.100 mmol/L；Pb2+最終濃度為2、3、4、5和6 mmol/L；Cr6+最終濃度為0.3、0.6、0.9、1.2和1.4 mmol/L；以不添加重金屬的YMA培養基為對照，接種后置于28 ℃恒溫培養，3～5 d后觀察生長狀況。

1.4 生物學特征

按照微生物基本試驗方法[5]，進行菌株菌落特征、細胞學特征和液體培養特征觀察等。

2 結果與分析

2.1 重金屬抗性

由表1可知，Cu2+濃度為0.15 mmol/L時所有菌株均生長很好，Cu2+濃度為0.50和0.90 mmol/L時，除菌株SQ12LD61和SQ12LD68存活外，其他菌株生長良好或很好，在Cu2+濃度為1.20和1.60 mmol/L時，SQ12LD61和SQ12LD68生長受到抑制，其他菌株存活；當Cu2+濃度為1.8 mmol/L時所有菌株均不生長。

由表2可知，所有菌株在Hg2+濃度為0.025 mmol/L時均能很好生長，在Hg2+濃度為0.050 mmol/L的培養基上菌株SQ12LD42、SQ12LD47、SQ12LD67和SQ12LD71都生長很好，其余菌株不同程度地受到影響；而在Hg2+濃度為0.075 mmol/L時這4株菌株存活，此濃度為最大抗性濃度。

由表3可知，所有菌株在Cr6+濃度為0.3和0.6 mmol/L的培養基上均生長很好或良好；在Cr6+濃度為1.2 mmol/L時有4株菌株（SQ12LD42、SQ12LD47、SQ12LD67和SQ12LD71）能夠存活，其他菌株生長均受抑制，此濃度為抗性最大濃度。

由表4可知，在Pb2+濃度為2、3、4 mmol/L梯度下菌株均能生長很好或良好；而Pb2+濃度為5 mmol/L時為菌株抗性的最大濃度，SQ12LD42、SQ12LD47、SQ12LD67和SQ12LD71仍存活。重金屬抗性結果分析可知，在設定重金屬濃度的培養基上，大豆根瘤內生菌對重金屬的最大抗性表現為Pb2+（5 mmol/L）>Cu2+（1.60 mmol/L）> Cr6+（1.2 mmol/L）>Hg2+（0.075 mmol/L）。另外，重金屬低濃度下對菌株沒有影響反而促進微生物的生長，高濃度下抑制菌體的正常生長，在一定濃度范圍內重金屬濃度和菌體生長趨勢呈負相關。

2.2 篩選菌株的生物學特性

根據對重金屬抗性結果，篩選出4株抗性較強的菌株，即SQ12LD42、SQ12LD47、SQ12LD67和SQ12LD71。經固體平板培養、液體培養，測量菌體大小等，生物學特征如表5。由表5可知，4株菌株的平板菌落特征均為濕潤、（半）透明、液體培養均產生絮狀沉淀并產生氣泡，革蘭氏染色SQ12LD42呈紫色，為革蘭氏陽性菌，其余3株為革蘭氏陰性菌。根據以上特征和依據《細菌分類手冊》與《伯杰氏細菌手冊》，初步判定4株菌株均為豆科植物根瘤內生細菌特征。

3 小結

篩選的4株菌均來源于努魯爾山北麓的內蒙古敖漢旗段，對重金屬均表現出較強抗性，這些抗性與采集地大豆的生長環境密切相關。內蒙古敖漢旗地下蘊藏著豐富的礦產資源，如鐵、金、銅、鎢、鉛、石灰石等，長期的自然選擇篩選出抗性強的菌株。而商丘市地處豫東平原，屬黃淮流域，地勢平坦，土壤多為沙壤土，除人為工業重金屬污染外沒有天然的重金屬污染礦區。徐亞軍等[6]研究表明，根瘤菌與豆科植物形成共生固氮體系，它的地理分布受到地形、土壤結構、氣候及宿主植物分布等影響。而內生菌和根瘤菌共處于根瘤微環境，它們與宿主植物形成了穩定的互惠互利關系，共同抵御外界不良環境的脅迫，提高了內生菌的抗逆性，可能也是內生菌抗重金屬的一個原因。

本試驗通過平板富集、群體效應進行，結果表明，菌株對不同重金屬濃度的抗性不同，低濃度促進菌體的生長，高濃度抑制菌體的生長。由于在低濃度下，這些重金屬離子是微生物生長所需的營養要素，如生物體中的某些酶是以Cu作為輔基，Cr與細胞膜穩定性、核酸結構以及生物體的正常代謝有關[7]。篩選出的4株菌能夠同時耐受多種重金屬，可能是通過分泌質子氨基酸以及各種有機酸，提高體系的酸度，溶解重金屬，或者利用代謝產物與重金屬配合改變形態[8]。有研究表明，快生型大豆根瘤菌在代謝過程中能分泌有機酸和各種氨基酸等代謝產物。

由于重金屬毒害使敏感菌喪失而耐受菌富集[9]，這使得微生物群落對環境脅迫的適應能力增強[10]。本試驗74株菌中，菌株對Pb2+的最大抗性濃度為5 mmol/L，對Cu2+的最大抗性濃度為1.60 mmol/L；對Hg2+的抗性最小，濃度為0.075 mmol/L。可見，菌株對不同重金屬間的抗性存在差異。抗性差異除了與菌株本身遺傳因素有關外，還與寄主植物的生態條件密切相關。這可能是由于根瘤內生菌與相應寄主植物對特殊環境長期相適應的結果[11]。繆福俊等[12]對會澤鉛鋅尾礦區豆科植物根瘤菌耐鉛鋅研究結果，王金華等[13]對蘭坪鉛鋅尾礦區植物根瘤菌對重金屬等因子的抗性研究，均支持了本研究結果。但對于每種重金屬的具體抗性機制以及抗性菌株的系統發育地位正在進一步的研究。

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（責任編輯 韓 雪）