17—β—雌二醇對豬卵母細胞體外成熟及體外受精胚的影響

肖紅衛　華再東　張立蘋　任紅艷　劉西梅　華文君　李莉　畢延震　鄭新民

摘要：為了觀察17-β-雌二醇對豬卵母細胞體外成熟及體外受精胚的影響，選用屠體卵巢上的卵母細胞為試驗材料，將其分為4組，分別在培養基中添加 0、25、50、75 μmol/L 17-β-雌二醇，體外成熟培養時間為36～44 h，受精胚培養時間為9 d。結果表明，在培養基中分別添加17-β-雌二醇0、25、50、75 μmol/L時豬卵母細胞體外成熟率分別為58.5%、67.1%、80.9%、64.5%，卵裂率分別為51.2%、56.5%、63.5%、59.2%，囊胚形成率分別為16.7%、24.2%、19.5%、24.0%。結果顯示在培養基中添加50 μmol/L 17-β-雌二醇可提高豬卵母細胞體外成熟率至80.9%，提高體外受精胚的卵裂率至63.5%，但囊胚形成率以添加量為25 μmol/L的組最高，說明添加17-β-雌二醇可提高豬卵母細胞成熟率、卵裂率以及囊胚率。

關鍵詞：17-β-雌二醇；卵母細胞；體外成熟；體外受精；胚胎培養

中圖分類號：S828.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）22-5660-02

Abstract： For observing the effect of 17-β-E2 on the porcine oocytes maturation and fertilized embryos development in vitro， the porcine oocytes collected from prepubertal gilts ovaries were cultured in maturation medium which added different concentration 17-β-estrodiol （0、25、50、75 μmol/L） for 36～44 hours. The fertilized eggs were cultured for 9 days. The results showed that the maturation rate of each addition was 58.5%， 67.1%， 80.9%， 64.5%， respectively. The cleavage rate was 51.2%， 56.5%， 63.5%， 59.2%， respectively， and the blastocyst rate was 16.7%， 24.2%， 19.5% and 24.0%， respectively. It indicated that the addition of 17-β-estrodiol could improve maturation rate， cleavage rate and blastocyst rate， and the maturation rate & cleavage rate of 50 μmol/L addition were higher than the other 3 groups， but the blastocyst rate of 25 μmol/L addition was higher than the other groups.

Key words： 17-β-estrodiol；porcine oocytes； in vitro maturation； in vitro fertilization； embryo culture

自Mattiol等[1]用屠體的卵母細胞獲試管豬以來，卵母細胞的體外成熟培養已經取得了較大的進展[2]。目前，研究者大多從屠宰場廢棄卵巢中獲取卵母細胞，但隨著中國養豬業的發展，生豬出欄時間從原來的5個月縮短到3個月，而3月齡的母豬尚未性成熟。因此，如何進一步提高卵母細胞的成熟效率，為胚胎工程技術準備更多優良的成熟卵母細胞就日益成為研究者所關注的焦點[3，4]。

雌二醇（E2）是體內主要由卵巢成熟濾泡分泌的一種天然雌激素，能促進和調節性器官及副性征的正常發育，臨床用于卵巢機能不全或卵巢激素不足引起的各種癥狀。本試驗在豬卵母細胞的成熟培養基中添加不同濃度的雌二醇，以研究其添加量對卵丘細胞體外成熟率的影響及對體外受精胚發育率的影響，旨在為胚胎工程技術的發展提供參考。

1 材料與方法

除特別標識外，所有試劑均購自Sigma公司，耗材為NUNC公司產品。

1.1 卵巢的采集、運輸、清洗及修剪

本試驗所用卵巢來自武漢市中糧肉食品加工廠屠宰場。剪下剛屠宰的直徑約1.0～2.5 cm、卵泡顏色清亮、形態正常（無過大、病變卵泡）且手感尚溫的卵巢（剪去卵巢上附帶的輸卵管和系膜），放入加有雙抗的35～38 ℃的滅菌生理鹽水中，在2 h內送回實驗室。隨后用等溫生理鹽水沖洗2～3次至無血水。

1.2 卵母細胞的采集

用帶有18 G針頭的注射器抽取卵巢表面卵泡（2～6 mm），將抽取液注入50 mL離心管（離心管置于38 ℃的水浴鍋中）中。待卵丘-卵母細胞復合體（COCs）沉淀后在立體顯微鏡下檢卵。選取帶有致密卵丘細胞的卵母細胞并對所得細胞進行分級比較。將檢出的COCs用加有雙抗的DPBS 洗滌3次，然后用卵母細胞操作液洗滌3次，移入當天上午在CO2培養箱中平衡的成熟培養液中。卵母細胞的培養采用四孔板培養法：每孔400 μL的培養體系內放入80枚卵，在5%CO2、95%空氣、38.5 ℃飽和濕度下培養36～44 h。

1.3 卵母細胞體外成熟情況的檢查

培養結束后，檢查卵丘擴散情況，再將卵母細胞移至0.1%透明質酸酶溶液中，渦漩振蕩法脫去卵丘細胞并在顯微鏡下檢查極體排出情況。

1.4 體外受精

將培養成熟的卵母細胞用透明質酸酶除去其外面的卵丘細胞。挑選胞質飽滿均勻、有第一極體的卵母細胞移入到預平衡的獲能液中洗滌 3～5次。然后用移卵管移入上蓋礦物油并在CO2培養箱中預孵1 h以上的受精液微滴中（50 μL），每滴放入10～15枚卵母細胞，置于 CO2培養箱（38.5 ℃、5%CO2、100%飽和濕度）中，等待受精。

將已經獲能的精子，調整精子濃度到2×106個/mL左右。然后取50 μL加入到等待受精的卵母細胞微滴中，于CO2培養箱（38.5 ℃、5%CO2、100%飽和濕度）中，共同孵育6 h。

1.5 胚胎培養

受精6 h后，將卵母細胞移入NCSU23中輕輕吹打，去除附著在受精卵周圍的精子，并用 NCSU23 洗滌3次，然后放入至少平衡2 h的NCSU23微滴（4 μg/mL BSA）中，每滴約10枚受精卵，培養條件為38.5 ℃、5%CO2、100%飽和濕度。受精當天記為第0天，第二天檢查卵裂情況，第六天檢查囊胚發育情況。

1.6 試驗設計

1.6.1 不同濃度17-β-雌二醇對卵母細胞成熟的影響 用以下配方對卵母細胞進行體外產生培養，36～44 h后，以出現第一極體者（pbⅠ）判為卵母細胞成熟，比較不同雌二醇添加濃度對卵母細胞成熟的影響。

mTCM199配方： TCM-199（Gibco）添加3.05 mmol/L葡萄糖、0.91 mmol/L丙酮酸鈉、0.57 mmol/L L-半胱氨酸、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL硫酸鏈霉素、10%（V/V）卵泡液、10 IU/mL孕馬血清促性腺激素（PMSG）和10 IU/mL人絨毛膜促性腺激素（hCG）。

試驗設置4個處理，分別為處理1：mTCM199+0 μmol/L 17-β-E2；處理2：mTCM199+25 μmol/L 17-β-E2；處理3：mTCM199+50 μmol/L 17-β-E2；處理4：mTCM199+75 μmol/L 17-β-E2。

1.6.2 不同雌二醇添加濃度對體外受精胚發育的影響 用NCSU23培養基對體外受精胚進行體外培養，出現卵裂后進行計數，并在出現囊胚后統計囊胚的數量，比較不同雌二醇添加濃度對體外受精胚發育的影響。

2 結果與分析

2.1 不同雌二醇添加濃度對卵母細胞成熟的影響

由表1可見，在成熟液中添加0、25、50、75 μmol/L 17-β-雌二醇的卵母細胞的成熟率分別為58.5%、67.1%、80.9%、64.5%。結果表明，成熟液中添加50 μmol/L17-β-雌二醇可提高卵母細胞的成熟率。

2.2 不同雌二醇添加濃度對體外受精胚發育的影響

由表1可見，在成熟液中添加0、25、50、75 μmol/L 17-β-雌二醇的卵母細胞的體外受精胚卵裂率分別為51.2%、56.5%、63.5%、59.2%；第六天的囊胚率分別為16.7%、24.2%、19.5%、24.0%。表明在培養基中添加50 μmol/L17-β-雌二醇組的卵裂率最高，但在囊胚形成率上以添加25 μmol/L17-β-雌二醇組最高，說明17-β-雌二醇在卵母細胞成熟上起作用，不同濃度的處理對后期胚胎發育的影響不同。

3 小結與討論

有關雌二醇在卵母細胞成熟中的作用有許多報道，但是對于不同物種得出的結論不一致[5-7]。李凱等[5]研究發現，雌二醇對小鼠卵母細胞的成熟及其發育潛力無明顯作用。呂麗華等[6]研究發現，在山羊卵母細胞體外成熟培養中，添加1 μg/mL雌二醇更有利于卵母細胞體外成熟培養，可使卵裂率提高17.6%。李繼鵬等[7]研究發現，在基礎培養液中添加濃度為2.0 μg/mL的雌二醇可促進犬卵母細胞核成熟到MⅠ-MⅡ期，但效果并不明顯。戈力等[8]研究發現，成熟液中添加1 μg/mL雌二醇對豬卵母細胞的體外成熟具有明顯的促進作用，而添加100 μg/mL 雌二醇對豬卵母細胞體外成熟具有明顯的抑制作用。

本研究發現，添加17-β-雌二醇可提高豬卵母細胞成熟率、卵裂率及囊胚率；但對于受精后的卵裂率，其中以添加50 μmol/L 17-β-雌二醇組效果最好，可促進豬卵母細胞的成熟，提高受精后胚胎的發育能力。

參考文獻：

[1] MATTIOLI M，BACCI M L，GALEATI G，et al.Developmental competence of pig ooctyes matured and fertilized in vitro[J].Theriogenology，1989，31（6）：1201-1207.

[2] 秦鵬春，譚景和，吳光明，等.豬卵巢卵母細胞體外成熟與體外受精的研究[J].中國農業科學，1995，28（3）：58-66.

[3] 孟慶剛，張成林，張永忠，等.豬小腔卵泡卵母細胞體外成熟研究[J].畜牧獸醫學報，2001，32（3）：213-219.

[4] 張 涌，劉素娟.山羊小腔卵母細胞的體外成熟培養和體外受精[J].西北農業大學學報，1996（4）：12-16.

[5] 李 凱，趙雁偉，郭 勇，等.雌二醇和孕酮對小鼠卵母細胞體外成熟的影響[J].中國實驗動物學報，2008，16（4）：293-297.

[6] 呂麗華，李富忠，岳文斌.成熟液中添加不同濃度雌二醇對山羊卵母細胞成熟的影響[J].黑龍江畜牧獸醫，2008（12）：37-38.

[7] 李繼鵬，尹熙俊，崔成都，等.雌二醇對犬卵母細胞體外成熟的影響[J].延邊大學農學學報，2013，35（2）：152-155.

[8] 戈 力，張運海，陶 勇，等.不同濃度雌二醇對豬卵母細胞體外成熟和孤雌激活胚胎的影響[J].畜牧與飼料科學，2011， 32（12）：9-11.

（責任編輯 曾德芳）