溫腎養血方對無排卵模型大鼠卵巢質量和形態的影響

辛明蔚，張秋霞，趙 暉，楊亦龍，何軍琴，梁欣韞，張 瑩，楊 維，武 穎，尹曉丹

（1．首都醫科大學附屬北京婦產醫院中醫科，北京 100026；2．首都醫科大學中藥學院，北京 100069；3．首都醫科大學，北京 100069）

溫腎養血方是北京婦產醫院中醫科趙松泉教授的經驗方，臨床應用30余年，療效顯著［1－3］。為進一步闡明其作用機制，本實驗利用無排卵大鼠動物模型，以溫腎養血方進行干預，通過觀察大鼠子宮和卵巢質量、卵巢形態學等相關指標，闡明溫腎養血方促進卵泡發育的作用。

1 材料

1．1 藥物 實驗用中藥飲片購自北京同仁堂股份有限公司。溫腎養血方為首都醫科大學附屬北京婦產醫院趙松泉主任醫師自擬方，由柴胡、香附、木香、赤芍、澤蘭、益母草、牛膝、雞血藤、紅花、丹參、當歸、川芎、蒲黃、熟地黃、淫羊藿、山茱萸、菟絲子、枸杞子、覆盆子、鹿角、羌活、細辛、肉蓯蓉等組成。水煎后濃縮成含生藥2．6g／mL的藥液，4℃冰箱儲存備用。枸櫞酸氯米芬片，每片50mg，高特制藥有限公司·塞浦路斯生產，產品批號為ED104。

1．2 儀器 JA－1003電子分析天平：上海精科天平廠；LEICA RM2235輪轉式石蠟切片機，LEICA HI1210攤片機，LEICA EG1150H 包埋機：德國；Nikon生 物 顯 微 鏡，NIS－Elements Basic Research圖像采集分析系統：日本。

2 方法

2．1 動物分組及模型復制 將50只大鼠按隨機數字表法隨機分為模型組，溫腎養血方大、中、小劑量組，西藥組，每組10只。另取22日齡大鼠10只作為正常組。

無排卵大鼠模型［4］（即雄激素致不孕大鼠模型）的復制：取9日齡SPF級雌性SD大鼠，于頸背部皮下注射丙酸睪酮1．25mg（0．05mL），至70日齡時陰道開口。連續陰道涂片2個性周期（每個性周期為5d），陰道上皮無性周期變化，提示無排卵大鼠模型復制成功。同樣，取9日齡雌性SD大鼠10只（正常組），于頸背部皮下注射等量蒸餾水，至70日齡時陰道開口。實驗組及正常組均于22日齡時斷奶，利用自然光照，室溫維持在20℃左右，同樣條件飼養，由專人飼養。

2．2 給藥方法 模型動物分組完成后，從80日齡起，分別給予相應藥物。模型組和正常組給予12 mL／kg蒸餾水。西藥組給予5．8mg／kg（臨床等效劑量）枸櫞酸氯米芬蒸餾水混懸液，每日灌胃1次，5d停藥。溫腎養血方小、中、大劑量組分別給予溫腎養血方13、26、52mg／kg，分別相當于成人臨床劑量的3．5、7．0、14．0倍，每日灌胃1次，連續21d。

2．3 取材方法 各組大鼠連續灌胃結束后，斷頭處死，取出子宮、雙側卵巢，去掉周圍脂肪組織，將子宮、卵巢迅速置于電子天平，稱質量，計算子宮指數和卵巢指數。

2．4 卵巢組織切片的制備 以上摘取的卵巢，置于4%多聚甲醛固定8～24h，脫水，透明，石蠟包埋，連續切片，片厚5μm，用于蘇木精－伊紅（hematoxylin－eosin，HE）染色。

2．5 統計學方法 實驗數據采用SPSS 17．0統計軟件包進行統計學分析。連續型變量采用“均數±標準差（±s）”進行統計學描述。由于這是單因素非平衡設計的組合實驗，故按研究目的分成3個組合。①正常組、模型組：采用兩個獨立樣本t檢驗比較體質量和卵巢質量指數，采用 Mann－WhitneyU檢驗比較子宮指數；②模型組和溫腎養血方大、中、小劑量組：采用單因素方差分析比較多組均數，采用LSD檢驗進行均數的多重比較；③西藥組和溫腎養血方大、中、小劑量組：采用單因素方差分析比較多組均數，采用LSD檢驗進行均數的多重比較。P＜0．05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3．1 模型因素對大鼠體質量、子宮指數和卵巢指數的影響 與正常組比較，模型組大鼠體質量無明顯變化（P＞0．05），子宮指數和卵巢指數顯著減少（P＜0．05）。見表1。

表1 模型因素對大鼠體質量、子宮指數和卵巢指數的影響（±s）

表1 模型因素對大鼠體質量、子宮指數和卵巢指數的影響（±s）

注：與正常組比較，P＜0．05。

組別 n 體質量／g子宮指數／（g／k g）卵巢指數／（g／k g）正常1 0 2 3 8．5 8±1 8．2 9 2．4 1±1．1 4 0．7 6±0．1 4模型 1 0 2 4 5．9 6±1 7．8 8 1．3 8±0．3 0＊ 0．4 0±0．0 8＊

3．2 藥物治療對無排卵模型大鼠體質量、子宮指數和卵巢指數的影響 與模型組比較，各治療組大鼠體質量、子宮指數和卵巢指數均無明顯變化（P＞0．05）；各治療組之間體質量、子宮指數和卵巢指數比較，差異也無統計學意義（P＞0．05）。見表2。

表2 藥物治療對無排卵模型大鼠體質量、子宮指數和卵巢指數的影響（±s）

表2 藥物治療對無排卵模型大鼠體質量、子宮指數和卵巢指數的影響（±s）

組 別 n 體質量／g子宮指數／（g／k g）卵巢指數／（g／k g）模 型1 0 2 4 5．9 6±1 7．8 8 1．3 8±0．3 0 0．4 0±0．0 8西 藥 1 0 2 1 4．0 5±1 9．5 6 1．3 1±0．2 8 0．4 0±0．0 8溫腎養血方（大） 1 0 2 3 8．9 6±1 8．5 7 1．4 2±0．2 4 0．4 0±0．0 6溫腎養血方（中） 1 0 2 4 3．9 0±1 0．7 1 1．3 4±0．2 0 0．4 2±0．0 7溫腎養血方（?。? 0 2 3 4．4 7±1 4．9 0 1．3 6±0．2 0 0．4 0±0．0 5

3．3 各組大鼠卵巢形態學比較 正常組大鼠卵巢組織明顯增大，部分卵巢表面有紅斑，各級生長發育都可見，卵泡數目較多，可見不同發育期卵泡及優勢卵泡，未見囊性擴張卵泡。卵巢表現出較多黃體，說明卵巢已有排卵。模型組及溫腎養血方小劑量組卵巢體積較小，卵巢表面蒼白，無斑點，色澤蒼白，卵泡數目少，卵泡較小，且形狀不規則，多呈囊性擴張，內含大量漿液性物質，腔內無卵丘及卵細胞，卵泡壁顆粒層細胞稀疏，層次明顯減少，無黃體。西藥組大鼠卵巢可見不同發育期卵泡，體積雖大但形狀不規則，細胞結構較紊亂，周圍透明帶厚薄不均勻，顆粒細胞層次減少，少量黃體形成。黃體細胞排列松散紊亂。溫腎養血方大、中劑量組大鼠卵巢的結構明顯改善，多數卵巢可見發育期的各級卵泡，擴張卵泡的顆粒層增厚，卵泡發育，卵泡內結構清晰，可見卵丘、卵細胞及典型黃體形成，黃體細胞大而圓，胞漿豐富。間質腺較模型組明顯增多。見圖1。

4 討論

王冰曰：“腎氣全盛，沖任脈通，經血漸盈，應時而下，沖為血海，任主胞胎，二脈相資，故能有子。”腎陰癸水是經血的物質基礎，血是月經的主要成分。腎氣封藏有度，肝氣疏泄有序，經血通過經脈，匯于血海，達于胞宮，血充氣暢，應時而下。沖任二脈隸屬肝腎，肝藏血，腎藏精，乙癸同源，精血互生，脾統血，為后天之本，氣血生化之源。女子又以肝為先天，以血為本。溫腎養血方中淫羊藿、肉蓯蓉、鹿角溫補腎陽，且溫而不燥，潤而生精；女貞子、覆盆子、枸杞子、山茱萸、菟絲子滋補肝腎之陰，同時取“陰中求陽”之意；柴胡、木香、香附疏肝解郁理氣；丹參、赤芍、生蒲黃、雞血藤、紅花、當歸、益母草補血活血，疏通經脈，化瘀生新；劉寄奴、蘇木祛瘀通絡；牛膝引藥下行，走而能補，使氣血得以暢行。以上諸藥意在補肝腎之精，使氣舒精足血暢，卵子成熟排出，月經如期而至，以攝精成孕。

卵泡的發生是一個復雜的過程，從原始卵泡開始發育到優勢卵泡的形成需要大約1年的時間。依次經過始基卵泡、竇前卵泡、竇狀卵泡及排卵前卵泡4個階段。無排卵多表現為卵泡在排卵前的閉鎖。Flerko等［5］認為卵泡膜毛細血管血流量的減少在導致大多數卵泡于竇前期閉鎖中發揮重要作用。有研究證實，與正常婦女相比，不孕癥患者卵巢動脈舒張期血流呈高阻抗、無成熟卵泡且卵巢甾體激素變化無規律，提示卵泡發育障礙、無排卵及不育患者存在卵巢血液供應障礙，且生殖器官血液供應與卵泡發育和生殖內分泌水平密切相關［6－7］。溫腎養血方于補腎藥物中配伍大劑量的補血活血藥物，其促進卵泡發育的作用機制可能與促進卵巢局部血液循環，影響卵巢的旁分泌和自分泌功能有關。方中雞血藤，陸象咸云：“曾見婦人合藥服之，多年不育者，后皆有子?！保ā侗静菥V目拾遺》）《本草綱目》曰：“澤蘭走血分，故能治水腫，涂癰毒，破瘀血，消癥瘕，而為婦人要藥。”藥理學研究［8］表明，澤蘭水煎劑能對抗體外血栓形成，有輕度抑制凝血系統與增強纖溶活性的作用?！侗静菝审堋分^蒲黃“味甘，氣平，無毒，血病必用，消瘀血凝積、癥瘕崩帶殊功，調女人月候不勻，去產婦兒枕作痛”。藥理學研究表明，蒲黃水浸液、煎劑或50%乙醇浸液均有促進凝血作用，且作用顯著而持久。蒲黃多種制劑能夠降低血壓、減輕心臟負荷，增加冠脈血流量，改善微循環，提高機體耐低氧能力，減輕心肌缺血性病變。《本草備要》謂牛膝“補肝腎，瀉惡血?！薄端幮越狻吩唬骸耙婺副竟χ窝嗜胫T陰之經。行血而不傷新血，養血而不滯瘀血，所以為胎產圣藥?！彼幚韺W研究［9］表明，丹參能改善血液流變性，降低血液黏度，抑制血小板和凝血功能，激活纖溶，對抗血栓形成。本方中配伍羌活、細辛兩味辛溫藥物，頗有深意。隋·巢元方《諸病源候論·婦人雜病諸候》中認為，女子不孕有內外兩方面因素。內因是勞傷氣血，正虛方使邪氣有機可乘，“婦人挾疾無子，皆由勞傷血氣，冷熱不調，而受風寒客于子宮，致使胞內生病，或月經澀閉，或崩血帶下，致陰陽之氣不和，經血之行乖候，故無子”。外因是六淫邪氣直中胞宮?！白优K冷無子者，由將攝失宜，飲食不節，乘風取冷，或勞傷過度，致風冷之氣乘其經血，結于子臟，故使無子”。認為風寒之邪入內客于胞宮，可致宮寒。血得寒則凝結，沖任、胞宮受損，導致月水不利或不通，則不能攝精成孕。指出正氣虧虛、風寒外侵是導致宮寒不孕的病機。因此，溫腎養血方中配伍祛風散寒的羌活、細辛可以去除沉疴痼疾，鼓動“腎間動氣”，打通沖任二脈?！侗静萁浭琛吩唬骸扒蓟钚詼兀缎?、苦，氣厚于味，浮而升，陽也。手足太陽行經風藥，并入足厥陰、少陰經氣分。女子疝瘕者，寒濕乘虛中腎家所致也，苦能燥濕，溫能澼寒，辛能發散，寒濕去而腎臟安，故主女子疝瘕，及療諸賊風，百節痛風無久新也。”蔣昌烈［10］臨床發現，不論何部位，只要在活血化瘀藥中加入細辛，可增強鎮痛與活血逐瘀作用。其曾對照觀察四肢骨折、脫位及身體各部位軟組織損傷之腫痛較重者55例，加用細辛者較單用活血化瘀藥者疼痛減輕快，瘀腫消退快。

本研究結果表明，模型復制后大鼠體質量無明顯變化，大鼠子宮指數和卵巢指數明顯降低（P＜0．05）。各治療組大鼠子宮指數和卵巢指數較模型組無明顯變化（P＞0．05），可能與樣本量小有關。有研究［11］表明，丹參具有促進卵泡發育和減少細胞凋亡的作用，能夠提高卵泡存活率。文獻［12］報道淫羊藿可增加小鼠子宮質量。肉蓯蓉能增強下丘腦－垂體－卵巢的促黃體功能，使大鼠子宮質量比對照組明顯增加［11］。菟絲子、紅花、丹參、肉蓯蓉等中藥可提高血清雌激素水平，但淫羊藿、女貞子、川牛膝可使血清雌激素水平有所下降［13］。以上這些研究提示，中藥復方作用機制和靶點可能是復雜的、綜合的、系統的，中藥復方的各種成分一起作用維持機體平衡，達到陰陽平衡，單一研究某種藥物的作用機制尚不能完整清楚地闡明中藥復方的作用機制。

［1］趙松泉．排卵湯治療95例各種排卵功能失調的觀察［J］．天津中醫，1985，2（4）：8－9．

［2］趙松泉．排卵湯治療不孕癥100例療效觀察［J］．北京中醫雜志，1993，12（2）：29－30．

［3］李玲．應用趙松泉老中醫排卵方治療不孕癥42例［J］．中國中醫藥現代遠程教育，2011，9（13）：13－14．

［4］俞瑾，楊淑萍，張月萍，等．雄激素致高胰島素高雄激素無排卵大鼠模型［J］．生殖醫學雜志，1993，2（4）：215－219．

［5］Flerko B，Setalo G，Tima L．Reproduction and development：advances in physiological sciences Vol．15［M］．Budapest：Pergamon press and Akademia Kiado press，1980：79－89．

［6］周莉，亓蓉，梁瑩，等．經陰道彩色多普勒觀察卵巢血流灌注與卵泡發育的關系［J］．生殖與避孕，2008，28（7）：441－443．

［7］蘇繼蓮，羅 潔，應偉雯．不孕婦女卵巢血供彩色多普勒特點與卵巢功能的相關性研究［J］．實用婦產科雜志，2008，24（4）：223－225．

［8］南京中醫藥大學．中藥大辭典［M］．2版．上海：上?？茖W技術出版社，2010：2063－2064．

［9］侯家玉．中藥藥理學：新世紀全國高等中醫藥院校規劃教材［M］．北京：中國中醫藥出版社，2007：145－146．

［10］蔣昌烈．細辛治跌打損傷效果好［J］．中醫雜志，1993，34（6）：327．

［11］唐飛，張魏，吳永根，等．丹參注射液對凍融小鼠卵巢移植早期光鏡結構及超微結構的影響［J］．解剖學報，2011，42（4）：542－547．

［12］趙丕文，王大偉，王玲巧，等．用小鼠子宮增重法篩選淫羊藿等10種中藥雌激素樣作用的實驗研究［J］．北京中醫藥大學學報，2006，29（10）：686－689．

［13］張曉暉，劉素香，徐敏．植物雌激素與中藥研究［J］．中藥新藥與臨床藥理，2002，13（4）：261－264．