紫藤瘤中化合物抗農(nóng)作物病原真菌活性研究

蔡百祥，王國凱，吳培云，劉勁松，許應(yīng)生，王 剛

（安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 現(xiàn)代中藥安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012）

植物病原真菌是指可以在植物上寄生并引起植物病害的真菌，已記載的植物病原真菌有8 000多種。真菌病害是植物病害中最重要的一種，所占比例最大，70%～80%的植物病害都是由真菌引起的，同時(shí)幾乎每種作物都有幾種甚至幾十種真菌病害。根據(jù)真菌病害的氣流和水流傳播比較突出的特點(diǎn)，可以采用化學(xué)藥劑進(jìn)行保護(hù)性防治，但效果有限［1］。植物源農(nóng)藥因其來源于自然，具有環(huán)保、長效、易光解、無殘留等優(yōu)點(diǎn)，成為發(fā)展有機(jī)農(nóng)業(yè)、促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的理想農(nóng)藥。紫藤Wisteriasinensis（Sims）Sweet是常見綠化植物，屬豆科紫藤屬。研究發(fā)現(xiàn)，紫藤具有殺菌作用［2］，紫藤葉片丙酮提取液對(duì)真菌和細(xì)菌均有一定的抑制作用［3］。紫藤瘤是紫藤莖上所生的贅瘤，可入藥，具有殺蟲、止痛、解毒等功效［4］，可用于癌癥的治療［5－6］。本課題組前期對(duì)紫藤瘤抗農(nóng)作物病原性真菌活性部位篩選進(jìn)行研究［7－8］，在確定其有效部位的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)有效部位中的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)研究［9－11］。為了篩選紫藤瘤抗病原性真菌的活性成分，本研究采用十字交叉法研究紫藤瘤分離得到的部分單體化合物對(duì)油菜菌核病菌、辣椒枯萎病菌、小麥赤霉菌和棉花枯萎病菌等誘發(fā)農(nóng)作物疾病的病原真菌的抑菌活性，為新型無公害生物農(nóng)藥的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 藥材 紫藤瘤藥材2011年購自安徽岳西，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)方成武教授鑒定為豆科植物紫藤Wisteriasinensis（Sims）Sweet的干燥莖瘤體。

1．2 作物病原真菌及培養(yǎng)基的制備 小麥赤霉菌（Fusariumgraminearum）、棉花枯萎病菌 （Fusariumoxysporumf．sp．vasinfectum）、辣椒枯萎病菌（Fusariumoxysporumf．sp．capsicum）、油菜菌核病菌（Sclerotiorumsclerotiorum）、玉米穗腐菌（Fusariummonilifome）由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院麻兵繼副教授提供。

馬鈴薯（去皮）200g，瓊脂20g，葡萄糖20g，水1 000mL。馬鈴薯煮30min，濾過，取汁，加入瓊脂和葡萄糖，煮至瓊脂完全融化，補(bǔ)水至1 000mL。分裝，121℃高壓滅菌30min，制得馬鈴薯－葡萄糖－瓊脂（potato dextrose agar，PDA）固體培養(yǎng)基。

1．3 供試化合物 丁香脂素、（3S）－7－O－methylvestitol、白樺脂酸均首次從紫藤瘤藥材中分離得到，經(jīng)波譜測(cè)定確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)［12］。

1．4 樣品的制備 分別精密稱取丁香脂素5．92 mg，（3S）－7－O－methylvestitol 25．85mg，白樺脂酸17．32mg，加入容量瓶中，加入少量二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）溶解，無菌水定容，配制成供試品溶液。

1．5 體外抗作物病原真菌活性試驗(yàn)

1．5．1 抑菌試驗(yàn)方法 采用菌落生長速率法［13］：1 mL供試液，加PDA固體培養(yǎng)基9mL無菌試管混勻，倒入無菌培養(yǎng)皿中制成帶藥的培養(yǎng)基平板，DMSO作空白對(duì)照。用無菌打孔器在活化后的作物病原真菌菌落邊緣切下直徑6mm生長一致的菌餅。將打好的菌餅菌絲面向下，接于培養(yǎng)基平板中心，使菌絲與新鮮培養(yǎng)基充分接觸，防止污染其他雜菌，26℃恒溫培養(yǎng)3～5d。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1．5．2 抑菌結(jié)果測(cè)量 采用十字交叉法，待空白對(duì)照菌落長至平板邊緣時(shí)，測(cè)量各培養(yǎng)皿中的菌落生長直徑，以3個(gè)重復(fù)菌落直徑的平均值計(jì)算菌絲生長抑制率。菌絲生長抑制率＝（空白對(duì)照菌落生長直徑－處理菌落生長直徑）／（空白對(duì)照菌落生長直徑－6）×100%。式中6為菌餅直徑，單位為mm。

2 結(jié)果

在前期研究基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)對(duì)從紫藤瘤中活性部位中分離到的單體化合物進(jìn)行活性研究，結(jié)果顯示化合物對(duì)小麥赤霉菌（Fusariumgraminearum）、棉花枯萎病菌（Fusariumoxysporumf．sp．vasinfectum）、辣椒枯萎病菌（Fusariumoxysporumf．sp．capsicum）、油菜菌核病菌 （Sclerotiorumsclerotiorum）、玉米穗腐菌（Fusariummonilifome）5種病原真菌均有較好的抑菌效果，尤其是對(duì)油菜菌核的抑菌效果最為顯著。丁香脂素在0．6mg／mL濃度下對(duì)油菜菌核病菌抑制率達(dá)到36．72%，（3S）－7－O－methylvestitol在0．75mg／mL濃度下對(duì)油菜菌核病菌抑制率達(dá)到40．26%，白樺脂酸在0．1 mg／mL濃度下對(duì)油菜菌核病菌抑制率更是達(dá)到84．52%，但對(duì)玉米穗腐菌無效。見表1。

表1 紫藤瘤化合物對(duì)5種農(nóng)作物病原真菌的體外抑制率

3 討論

本研究對(duì)紫藤瘤抗農(nóng)作物病原性真菌的活性部位進(jìn)行篩選，紫藤瘤乙醇提取物對(duì)5種病原真菌都有較好的抑菌效果，且對(duì)油菜菌核病菌、棉花枯萎病菌、小麥赤霉病菌的抑菌率高達(dá)50%。石油醚、乙酸乙酯和正丁醇部位對(duì)油菜菌核病菌、辣椒枯萎病菌、小麥赤霉病菌的抑菌率高達(dá)50%左右，尤其對(duì)油菜菌核病菌抑菌率更是達(dá)到100%［7－8］。但是，前期研究結(jié)果僅限于對(duì)紫藤瘤提取部位農(nóng)作物抗病原真菌活性，因此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)從紫藤瘤中分離到的化合物活性進(jìn)行研究，結(jié)果顯示化合物對(duì)小麥赤霉病菌、辣椒枯萎病菌、棉花枯萎病菌、油菜菌核病菌、玉米穗腐病菌5種病原真菌均有較好的抗農(nóng)作物病原真菌活性，尤其是對(duì)油菜菌核病菌最為顯著。

植物源農(nóng)藥是生物殺蟲劑家族中開發(fā)最成功的一類。其兩個(gè)主導(dǎo)產(chǎn)品為從菊屬植物花中提取的除蟲菊素，以及從印楝樹種子提取的印楝素。一些植物提取物，如印楝素和Queium，這些植物源農(nóng)藥活性和相對(duì)應(yīng)的合成物質(zhì)的活性一樣，但作用方式不同，是綜合治理害蟲的產(chǎn)品［14］。而紫藤瘤提取物及化合物具有良好的抗真菌活性，這可能是由于植物紫藤經(jīng)真菌侵蝕，誘導(dǎo)次生代謝產(chǎn)物的發(fā)生和積累在莖體上寄生的病變組織。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紫藤瘤提取部位抗農(nóng)作物病原真菌活性強(qiáng)于化合物，可能是由于次生代謝產(chǎn)物協(xié)同作用表現(xiàn)出更強(qiáng)的生物活性。紫藤瘤活性部位及成分對(duì)于農(nóng)作物病原真菌有著很好的抑制效果，提示紫藤瘤在生物農(nóng)藥開發(fā)領(lǐng)域，具有很好的發(fā)展前景及研究?jī)r(jià)值，可將其應(yīng)用于植物源生物農(nóng)藥的開發(fā)上。同時(shí)，紫藤瘤可用于癌癥的治療［5－6］，提示其也具有進(jìn)一步開發(fā)藥用的價(jià)值。

［1］闕友雄，宋弦弦，許莉萍，等．植物與病原真菌互作機(jī)制研究進(jìn)展［J］．生物技術(shù)通訊，2009，20（2）：282－285．

［2］羅充，理艷霞，張偉，等．19種園林植物組織殺菌作用的研究［J］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，33（5）：810－811．

［3］姜艷華，樊曉暉，姜華，等．紫藤活性成分的提取與抑菌作用初探［J］．河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（3）：60－62，78．

［4］馮洪錢，馮新英，王成．日本《假名安驥集》疑難土草藥考注［J］．農(nóng)業(yè)考古，2008（4）：281－284．

［5］林博夫，楊世忠．中藥 W、T、T、C治療胃癌獲顯效［J］．廣西中醫(yī)藥，1983，6（4）：48

［6］趙耀先．對(duì)《中藥 W、T、T、C治療胃癌獲顯效》譯文的幾點(diǎn)意見［J］．廣西中醫(yī)藥，1984，7（2）：53．

［7］吳培云，劉勁松，陳愛民，等．紫藤瘤提取物抗病原真菌活性研究［J］．中成藥，2012，34（10）：2018－2020．

［8］許應(yīng)生，吳培云，劉勁松，等．紫藤瘤不同溶劑提取部位抗農(nóng)作物病原真菌活性研究［J］．廣西植物，2013，33（1）：132，133－135．

［9］劉勁松，陳愛民，許應(yīng)生，等．紫藤瘤三萜類化學(xué)成分研究［J］．中藥材，2012，35（8）：1246－1250．

［10］陳愛民，吳培云，劉勁松，等．紫藤瘤化學(xué)成分研究［J］．安徽醫(yī)藥，2012，16（1）：18－20．

［11］劉勁松，陳愛民，許應(yīng)生，等．紫藤瘤酚性成分研究［J］．中藥材，2013，36（9）：1437－1440．

［12］王國凱，劉勁松，許應(yīng)生，等．紫藤瘤抗農(nóng)作物病原性真菌活性部位化學(xué)成分研究［J］．中藥材，2014，37（7）：1187－1189．

［13］江茂生，許文耀．艾蒿提取物對(duì)13種植物病原菌物的抑制作用［J］．福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007，36（4）：352－356．

［14］招衡，張翼翾．生物農(nóng)藥及其未來研究和應(yīng)用［J］．世界農(nóng)藥，2010，32（2）：16－24，30．