卡培他濱聯合不同歸經引經藥抗乳腺癌肺轉移療效研究

劉玲琳 徐海濱 胡祖健 何俊玲 楊慧芬 劉勝?

卡培他濱聯合不同歸經引經藥抗乳腺癌肺轉移療效研究

劉玲琳 徐海濱 胡祖健 何俊玲 楊慧芬 劉勝?

目的 探討卡培他濱聯合不同歸經引經藥（桔梗、川牛膝）對小鼠4T1乳腺癌肺轉移模型中原位瘤、肺轉移灶的療效差異。方法 建立Balb/c小鼠4T1乳腺癌肺轉移模型，隨機分為桔梗組、川牛膝組、卡培他濱+桔梗組、卡培他濱+川牛膝組、卡培他濱組（西醫陽性藥對照）和空白對照組。繪制各組給藥期間原位瘤體積生長曲線，給藥結束后比較各組瘤重、瘤重抑制率及肺轉移情況。結果 各藥物組在給藥中后期對4T1小鼠原位瘤均有一定的抑制作用。給藥結束后，與對照組比較，卡培他濱、卡培他濱+桔梗、卡培他濱+川牛膝組差異均有統計學意義（P＜0.05），其中與單藥卡培他濱組比較，卡培他濱+桔梗組抑瘤作用更強（P＜0.05）。在瘤重和瘤重抑制率方面，與對照組比較，僅卡培他濱+桔梗組差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。在肺轉移方面，卡培他濱+川牛膝組顯示出一定的促進作用，余組均顯示出不同程度的抑制作用。與對照組比較，卡培他濱組與卡培他濱+桔梗組差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01），且后者抗肺轉移作用更佳。結論 與單藥卡培他濱比較，卡培他濱聯合桔梗可進一步抑制4T1荷瘤小鼠原位瘤及肺轉移灶的發生發展，而卡培他濱聯合川牛膝在原位瘤抑制方面弱于單藥卡培他濱，在肺轉移方面則觀察到有促進作用，提示卡培他濱配伍不同歸經引經藥（桔梗、川牛膝）在乳腺癌特異性肺轉移中存在療效的差異性和靶器官的選擇性。

乳腺癌 肺轉移 引經藥 桔梗

肺轉移是乳腺癌最常見的內臟轉移之一，乳腺癌肺轉移是乳腺癌治療中的重點和難點［1］。本研究通過觀察卡培他濱聯合不同歸經引經藥（桔梗、川牛膝）在4T1乳腺癌特異性肺轉移模型中的療效差異，以期為中醫藥抗乳腺癌肺轉移的臨床實踐提供實驗依據。報道如下。

1 材料和方法

1.1 動物 Balb/c小鼠60只，雌性，18g左右，由中國科學院上海實驗動物中心提供，動物訂購至上海中醫藥大學實驗動物中心后，無特定病原體（SPF）環境飼養，常規飲水，飼料供應，飼養1周后開始實驗。

1.2 細胞株及細胞培養 小鼠4T1乳腺癌細胞株購自ATCC，由上海中醫藥大學科技實驗中心保存，培養于含10%胎牛血清、100 Unit/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養基，37℃培養箱培養。

1.3 實驗用藥及試劑儀器 （1）藥物：桔梗、川牛膝（購自上海養和堂中藥飲片有限公司），卡培他濱片（希羅達）（上海羅氏制藥有限公司）。（2）試劑及儀器：RPMI-1640培養基、胎牛血清（美國Gibco）；Bouin固定液：苦味酸飽和液（1.22%）75ml、福爾馬林25ml、冰醋酸5ml；HF1200 A2型生物安全柜（力新儀器上海有限公司）；XDS-B型倒置顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）；3110 Thermo型 CO2培養箱（美國熱電）；Milli-Q超純水系統（美國Millpore）；HISTOSTAT-820切片機（美國RMC）；EVOS大屏幕數碼倒置顯微鏡 （美國AMG）；NIKON 4500數碼相機（日本NIKON）。

1.4 乳腺癌肺轉移動物模型建立 取對數生長期體外培養的小鼠4T1細胞株（肺高轉移潛能），采用無血清的RPMI 1640培養基調整單細胞懸液濃度為1×107/ ml。無菌條件下，接種于Balb/c小鼠右側第二乳頭的脂肪墊上，接種量為0.1 ml/只（細胞數為1×106/只）。1.5 分組與給藥 共分6組，分別為桔梗組、川牛膝組、桔梗+卡培他濱組、川牛膝+卡培他濱組、卡培他濱組（西醫陽性藥對照）和空白對照組。實驗動物原位瘤長徑至2mm后，隨機分組，每組10只，給藥劑量按人鼠等效劑量換算，給藥周期4周。

1.6 觀察指標 （1）給藥期間瘤體積生長曲線：給藥期間，每4d予游標卡尺測其原位瘤長、短徑，計算瘤體積，公式如下：V=1/2ab2（a為長徑，b為短徑）。（2）瘤重、瘤重抑制率：給藥結束后，稱量裸鼠體重后脫頸處死裸鼠，摘除腫瘤、剔除筋膜，記錄瘤重、計算瘤重抑制率，公式如下：瘤重抑制率（%）=［（對照組平均瘤重-實驗組平均瘤重）/對照組平均瘤重］×100%。（3）腫瘤肺轉移評價：①肺臟病理切片制作與評價：每組隨機選6個肺組織（右肺）經生理鹽水沖洗后，置于10%福爾馬林液中固定。經不同濃度酒精逐級脫水、石蠟包埋、連續切片，制成4μm切片，蘇木精、伊紅染色，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下攝影，并評價腫瘤轉移情況及其它可見的病理改變。②肺結節定量：每組隨機選8個肺組織（右肺）經生理鹽水沖洗后，置于Bouin固定液中。固定1周后，樣本正常肺組織呈黃色，肺部結節（腫瘤轉移灶）不被染色呈白色，根據結節的大小（直徑）與數量進行評分：1分為＜1mm，2分為1mm，3分為2mm，4分為≥3mm。統計每個樣品的評分總數，評價腫瘤轉移情況。

1.7 統計學方法 采用SPSS11.5統計軟件。計量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 給藥期間各組實驗動物原位瘤體積變化 各藥物組在給藥中后期對4T1荷瘤小鼠原位瘤均有一定的抑制作用。給藥結束后，與對照組比較，卡培他濱組、卡培他濱+桔梗祖、卡培他濱+川牛膝組差異均有統計學意義（P均＜0.05）。與單藥卡培他濱組比較，卡培他濱+桔梗組顯示出更好的抑瘤作用（P＜0.05），提示“引經上行”中藥桔梗與卡培他濱協同使用，可提高卡培他濱的抗癌活性。見圖1。

2.2 原位瘤實體形態 見圖2。

圖1 給藥期間各組4T1乳腺癌原位瘤體積變化

圖2 各組原位瘤實體形態

2.3 瘤重 給藥結束后，與對照組比較，只有卡培他濱+桔梗組在瘤重方面差異明顯（P＜0.05），提示桔梗配伍卡培他濱比單藥卡培他濱抑瘤作用好，見圖3。

圖3 各組瘤重

2.4 瘤重抑制率 在瘤重抑制率方面，各藥物組對原位瘤均有一定程度的抑制作用，但僅卡培他濱+桔梗組與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.01），見圖4。2.5 肺臟病理 見圖5。

圖4 各組瘤重抑制率

圖5 4T1乳腺癌肺轉移模型各組肺轉移灶病理

2.6 肺結節定量 在4T1荷瘤小鼠肺轉移方面，卡培他濱+川牛膝組顯示出一定的促進作用。余藥物組均顯示出一定的抑制作用，其抑制肺轉移作用由低到高依次為：牛膝組、桔梗組、卡培他濱組、卡培他濱+桔梗組。其中與對照組比較，卡培他濱組與卡培他濱+桔梗組差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01），且卡培他濱+桔梗組抑制肺轉移作用優于單藥卡培他濱組，見圖6。

圖6 各組肺轉移結節數

3 討論

乳腺癌是嚴重威脅女性健康的惡性腫瘤，已居我國城市女性惡性腫瘤發病率首位［2，3］。肺轉移是乳腺癌最常見的內臟轉移之一，目前現代醫學針對乳腺癌肺轉移的治療采用以化療為主的綜合治療，如何進一步提高乳腺癌肺轉移的臨床療效是醫學界持續探討的熱點問題。

本研究選擇中醫學藥物桔梗為引藥上行的肺經經典引經藥，《本草求真》中論述“桔梗系開肺氣之品，可為諸藥舟楫，載藥上浮”，具有引藥入肺，提高療效的作用。現代藥理研究發現，桔梗具有抗炎鎮痛、祛痰鎮咳、降脂降糖、抑制胰酶活性、改善胰島素抵抗、促進膽酸分泌、抗腫瘤及免疫調節等廣泛的生物學活性［4～6］。桔梗水提物或甲醇提取液具有較強的抗癌活性［7］。而桔梗皂苷是良好的表面活性劑，能增加其他藥物的吸收［8］。川牛膝則具有引藥下行的作用，《寒溫條辨》中有云“牛膝，生用其性下走如奔，破血癥，通經閉，引諸藥下行”，現代藥理研究顯示，牛膝多糖能顯著提高S180荷瘤小鼠脾細胞誘生殺傷細胞（LAK）活性和腫瘤壞死因子β（TNF-β），具有廣泛殺傷腫瘤細胞和異質細胞的能力，且與化療藥物環磷酰胺有協同抗腫瘤作用［9］。研究發現，川牛膝多糖能增強正常小鼠特異性和非特異性免疫功能，并對環磷酰胺導致的白細胞數量減少具有一定的減毒作用［10］。本資料選用川牛膝作為桔梗的中醫藥對照，比較卡培他濱聯合桔梗或川牛膝在抗乳腺癌特異性肺轉移治療中是否存在療效的差異性和靶器官的選擇性。

本資料結果顯示，各藥物組在給藥中后期對4T1荷瘤小鼠原位瘤均有一定的抑制作用。給藥結束后，與對照組比較，卡培他濱組、卡培他濱+桔梗祖、卡培他濱+川牛膝組均顯示出一定的抑瘤抗癌活性。而與單藥卡培他濱比較，卡培他濱聯合引藥上行中藥“桔梗”后可進一步提高4T1荷瘤小鼠原位瘤及肺轉移灶的抑制作用。而卡培他濱聯合引藥下行中藥“川牛膝”在原位瘤抑制作用方面弱于單藥卡培他濱，在肺轉移方面觀察不僅無抑制作用，而且具有促進肺轉移的作用。而單味藥桔梗和川牛膝比較，川牛膝在4T1荷瘤小鼠原位瘤的抑制作用優于桔梗，而桔梗在肺轉移抑制方面則優于川牛膝，提示卡培他濱配伍不同歸經引經藥（桔梗、川牛膝）在乳腺癌特異性肺轉移中確實存在療效的差異性和靶器官的選擇性。本研究從實驗角度佐證中醫引經藥及歸經理論在中醫藥抗乳腺癌及轉移性乳腺癌治療中的科學性和合理性。

在抗乳腺癌轉移有效的西藥卡培他濱基礎上聯合肺經引經藥桔梗可進一步提高抑制4T1荷瘤小鼠原位瘤及肺轉移發生發展的作用，為抗乳腺癌肺轉移有效復合制劑的研發提供思路和方法，從而為中醫藥防治乳腺癌肺轉移的臨床治療提供新的選擇。在此基礎上，進一步深入研究卡培他濱聯合桔梗發揮良好抗乳腺癌肺轉移作用的可能機制是值得繼續研究的方向。

1 Andre F, Slimane K, Bachelot T, et al． Breast cancer with synchronous metastases: trends in survival during a 14-year period． J Clin Oncol, 2004, 22(16): 3302～3308．

2 鄭瑩,吳春曉,張敏璐．乳腺癌在中國的流行狀況荷疾病特點．中國癌癥雜志,2013,23(8):561～569．

3 趙平, 陳萬青, 孔靈芝． 中國癌癥發病與死亡2003-2007．北京: 軍事醫學科學出版社,2012．121．

4 付文衛,竇德強,裴月湖．桔梗的化學成分和生物活性研究進展．沈陽藥科大學學報,2006,23(3):184～189．

5 武博,劉萍．桔梗的現代研究進展．中國藥物應用與檢測,2008,5(2): 48～50．

6 郭文杰,許旭東,魏建和,等．桔梗中三萜皂苷類化學成分研究進展．中國藥學雜志,2008,43(11):801～804．

7 Choi C K,Kim J Y,Kim Y S,et al．Augmentatation of macrophage functions by an aqueous extact isolated from Platycodon grandiflorun．Cancer Lett, 2001,166(1):17～25．

8 中國醫學科學院藥物研究所編．中草藥現代研究(第二卷)．北京:北京醫科大學中國協和醫科大學聯合出版社,1996．202．

9 余上才,章育正．牛膝多糖抗腫瘤作用及免疫機制實驗研究．中華腫瘤雜志,1995,17(4):275～278．

10 王劍,付田,浦薔,等．川牛膝多糖的體內免疫活性研究．中藥藥理與臨床．2007,23(6):31～33．

Objective To observe the different efficacy of capecitabine plus different meridian-guiding herbs（platycodon grandiflorum、radix cyathulae）for the treatment of lung metastasis from breast cancer in vivo. Methods Establishment of 4T1 breast cancer lung metastasis Balb/ c mice model.60 mice were randomly assigned to 6 groups：platycodon grandiflorum、radix cyathulae、capecitabine plus platycodon grandiflorum、capecitabine plus radix cyathulae、capecitabine and control group. Description of tumor growth curve during the administration，calculation of tumor weight、inhibition rate of tumor weight and quantitative analysis of inhibition in lung metastasis. Results Capecitabine、 capecitabine plus platycodon grandiflorum and capecitabine plus radix cyathulae groups indicated some degree of inhibition effect in tumor growth（P＜0.05），capecitabine plus platycodon grandiflorum played a better inhibition in primary tumor compared with capecitabine（P＜0.05）.Only capecitabine plus platycodon grandiflorum demonstrated efficacy at tumor weight and inhibition rates of tumor weight compared with control group（P＜0.05）.Capecitabine plus radix cyathulae group promoted lung metastasis，while other groups inhibited lung metastasis compared with control group（P＜0.05，P＜0.01）. Conclusion Capecitabine plus platycodon grandiflorum played a better inhibition both in primary tumor and lung metastasis，while capecitabine plus radix cyathulae showed weaker suppression in primary tumor and promoted lung metastasis compared with control group. The study indicated that capecitabine plus different meridian-guiding herbs showed different inhibition efficacy in lung metastasis of breast cancer.

Breast cancer Lung Metastasis Meridian-guiding herb Platycodon grandiflorum

浙江省中醫藥科學研究基金計劃（2011ZB113）；杭州市科技局項目（20110733Q28）；杭州市衛生局項目（2011Z015）

310007杭州市中醫院乳腺外科（劉玲琳 徐海濱 胡祖健 何俊玲 楊慧芬）

200032上海中醫藥大學附屬龍華醫院乳腺外科（劉勝）

*通訊作者