基于石墨烯－依來鉻青藍R的新型免標記電化學免疫傳感器用于CA19－9檢測

于魯平，蔣周倩，蔡小輝，林麗清，翁少煌，林新華

CA19－9是一種消化道腫瘤相關糖抗原，以唾液黏蛋白的形式存在于血清中，也分布于正常胎兒的胰腺、膽囊、肝、腸和正常成年人的胰腺、膽管上皮等處，是存在于血液中的消化道腫瘤相關抗原。正常人血清中CA19－9的臨界參考值為37U／mL，如明顯升高，可以指示消化道腫瘤，特別是胰腺癌，并能作為臨床診斷胰腺癌的常規指標之一[1－2]。目前，臨床上主要采用化學發光（CL）和電致化學發光（ECL）等方法檢測 CA19－9[3－4]，但存在試劑昂貴、操作繁瑣等不足。電化學免疫傳感器具有靈敏度高、可操作性強的特點，是檢測生物大分子的重要技術手段[5]。免標記電化學免疫傳感器是新近發展的新型檢測方法，通過識別生物大分子反應過程中信號響應的變化而實現目標物的檢測，具有靈敏度高、操作簡便、響應快速、易小型化和價格便宜等優點。近年，多種新型的信號產生方式用于免標記電化學免疫傳感器的構建，比如硫堇和普魯士藍等信號指示體系[6－7]。本研究采用滴涂法在電極表面修飾化學法合成的氧化石墨烯（GO），然后通過電聚合制備石墨烯－依來鉻青藍R（GO－ECR）修飾電極，利用ECR表面富含的羧基通過酰胺反應將CA19－9單克隆抗體（Anti－CA19－9）固定于電極表面，根據抗體－抗原反應固定CA19－9，檢測CA19－9固定前后修飾電極對鐵氰化鉀響應的差異，定量檢測CA19－9的濃度。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 電化學檢測系統（Autolab PGSTAT302F，荷蘭Eco Chemie公司），電化學分析儀（CHI 660C，上海辰華儀器有限公司）。采用三電極體系：工作電極為玻碳電極（GCE，直徑為3mm），對電極為鉑絲電極，參比電極為Ag／AgC1電極。恒溫恒濕培養箱[CTHI－150B，施都凱儀器設備（上海）有限公司]；CA19－9單克隆抗體（英國Abcam公司），CA19－9標準品（日本Tosoh公司），石墨（南京先豐納米材料科技有限公司），依來鉻青藍R（C23H15Na3O9S，上海阿拉丁試劑有限公司），1－乙基－（3－二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和N－羥基硫代琥珀酰亞胺鈉鹽（NHS）（美國Sigma－Aldrich公司）。含10mmol／L鐵氰化鉀電對（[Fe（CN）6]3－與[Fe（CN）6]4－的物質的量比為1∶1）的10mmol／L PBS緩沖溶液（pH 7.4，實驗室自制）。所有試劑均為分析純，實驗用水為Millipore超純水。

1.2 方法

1.2.1 GCE的處理 GCE用0.3和0.05μm氧化鋁微粉依次拋光，然后依次用硝酸溶液（體積比為1∶1）、無水乙醇、去離子水超聲清洗5min，超純水清洗，N2吹干備用。

1.2.2 GO的制備 根據Hummers改進方案合成GO，控制冰浴條件下，于圓底燒瓶中小心加入濃 H2SO4∶濃 H3PO4（9∶1），之后分別加入0.5g石墨和3g KMnO4，控制冰浴條件反應3h，然后升溫至35℃，氧化反應1h，繼續升溫至50℃，反應12h；在冰浴條件下加入67mL的冰水，滴加30%H2O2至溶液變為亮黃色，5 000r／min下離心10min，收集沉淀，分別用雙蒸水和30%HCl洗滌3次，用乙醇洗至中性，在室溫條件下真空干燥24h，得到干燥的GO。

1.2.3 基于 GO－ECR 活性傳感界面檢測 CA19－9的免標記電化學免疫傳感器的構建 將20mg的GO超聲分散于1mL去離子水中，并進一步稀釋成0.2mg／mL的GO分散液。將5μL的GO分散液滴于處理好的GCE表面，抽干，即得GO／GCE。將GO／GCE置于ECR溶液中，控制電位范圍為－0.4～1.6V，掃描速度為0.1V／s，循環伏安（CV）法掃描20圈電聚合，去離子水沖洗電極并用氮氣吹干，得 ECR－GO／GCE。EDC、NHS活化ECR－GO／GCE表面的羧基，滴加1mg／mL的CA19－9抗體反應1h，并用0.1%BSA溶液封閉殘留活性位點，得到Anti－CA19－9／ECR－GO／GCE。之后，將不同濃度的CA19－9標準品滴加于Anti－CA19－9／ECR－GO／GCE表面，抗原－抗體免疫反應，分別用PBS和蒸餾水沖洗電極修飾界面，除去未反應的CA19－9，最后在pH 7.4的鐵氰化鉀電對中進行電化學檢測，對比抗原－抗體反應前后的電流信號的差異，信號變化情況用于CA19－9濃度的定量計算，如圖1所示。

圖1 非標記型電化學免疫傳感器檢測CA19－9的構建原理圖Fig 1 The schematic diagram of preparation of label－free electrochemical immunosensor for the detection of CA19－9

1.2.4 血清樣品的測定 血清樣品由福建醫科大學附屬第一醫院提供，應用本研究構建的方法測定血清CA19－9，對比1.2.3的測定過程，除了用血清樣品代替CA19－9標準品外，其他操作保持一致，采用1.2.3的定標曲線校準得到CA19－9的濃度，并與臨床ECL分析法的測定結果做對比。

2 結 果

2.1 CA19－9抗體固定的形貌表征 免疫傳感器制作過程中CA19－9抗體固定前后修飾電極的形貌如圖2所示。圖2A為裸GCE，其表面光滑平整，出現一些電極處理過程引起的輕微劃痕，也出現少量凸起。GCE修飾ECR－GO之后，電極表面呈現出粒徑較小、高度起伏較小的粗糙突起（圖2B）；經過EDC、NHS 活 化，在 ECR－GO／GCE 表 面 固 定CA19－9 抗 體 后，得 到 的 Anti－CA19－9／ECR－GO／GCE，其表面顯著變化，出現明顯的簇狀突起，且突起粒徑變大（圖2C）。

圖2 不同電極界面的AFM圖Fig 2 AFM images of the surface of different modified electrodes

2.2 非標記型免疫傳感器的電化學表征 非標記型免疫傳感器檢測CA19－9制作過程中不同修飾步驟的電化學表征圖見圖3。圖3A為傳感器制作過程不同步驟在鐵氰電對溶液中的CV圖。從圖可以看出，GCE顯示出鐵氰化鉀可逆的氧化還原峰（曲線a）；當在GCE表面修飾GO，得到GO／GCE，鐵氰化鉀的氧化還原峰電流減小（曲線b）；在GO／GCE表面聚合ECR后，得到ECR－GO／GCE，鐵氰化鉀的氧化還原峰電流明顯減小（曲線c）；在ECR－GO／GCE上固定CA19－9抗體后，鐵氰化鉀的氧化還原峰電流有所增大（曲線d）；用BSA封閉抗體修飾電極（Anti－CA19－9／ECR－GO／GCE），鐵氰化鉀的氧化還原峰電流略微減小（曲線e）；修飾電極與CA19－9反應并固定CA19－9之后，鐵氰化鉀的氧化還原峰電流相對抗體修飾電極明顯減小（曲線f）。CV結果證實，隨著電極的逐步修飾，氧化還原電流響應逐漸變化。圖3B為傳感器不同修飾步驟在鐵氰電對溶液中的差分脈沖伏安圖（DPV），顯示出鐵氰化鉀在電極表面變化的氧化峰。從圖可以看出，DPV的鐵氰化鉀氧化峰電流變化規律與CV圖中的氧化還原峰變化一致，但是DPV的氧化峰電流的變化比較明顯。應用抗體修飾電極（曲線e）和免疫反應固定抗原的電極（曲線f）前后峰電流差值（ΔI）可以定量分析CA19－9的濃度。

2.3 傳感器的特異性 在相同實驗條件下，DPV檢測所制備的傳感器對血清中常見干擾物的響應，如圖4所示，相近濃度的蛋白標志物對傳感器電流響應信號的變化值明顯小于CA19－9的電流信號變化，所制備的傳感器能夠顯著區分CA19－9和其他干擾物的信號。

2.4 傳感器檢測CA19－9的線性關系 在最佳實驗條件下，用制備的傳感器測定一系列不同濃度的CA19－9。如圖5所示，隨著CA19－9濃度的增大，DPV的氧化峰電流逐漸減小。在0.05～500U／mL范圍內，電流變化值與CA19－9濃度的對數值呈良好的線性關系（圖5插圖），線性回歸方程如下：

相關系數R為0.995 1，根據信噪比為3計算，得到檢測限為0.01U／mL。

2.5 傳感器對血清樣品的測定 采用制備的傳感器檢測5份臨床血清樣品中的CA19－9，并與ECL檢測結果進行比較（表1）。傳感器檢測結果的相對標準偏差（RSD）＜10%，與ECL檢測結果相對偏差的絕對值也是＜10%。

圖3 不同修飾電極在[Fe（CN）6]3－／4－溶液中的電化學響應Fig 3 The electrochemical response of different modified electrodes in [Fe（CN）6 ]3－／4－solution

圖4 在相同實驗條件下用所制備的傳感器檢測濃度為5ng／mL的胰蛋白酶、CEA、PSA、AFP和5U／mL的CA125、CA153及CA19－9的直方圖Fig 4 The histogram of anodic peak current responses of the immunosensor toward trypsin，CEA，PSA and AFP with concentration of 5ng／mL，CA125，CA153，and CA19－9with the concentration of 5U／mL

表1 血清樣品中CA19－9的測定Tab 1 Detection results of CA19－9in five real serum samples

圖5 檢測不同濃度CA19－9的差分脈沖伏安圖Fig 5 The differential pulse voltammetry of the immunosensor for CA19－9of different concentrations

3 討 論

GO是通過碳六元環組成的新型二維納米材料，表面含有大量的含氧基團，具有良好的親水性和生物兼容性，常用于固定生物活性分子以構建新型的生物檢測裝置，比如電化學免疫傳感器[8]。GO可通過與聚合物薄膜復合以制作電化學免疫傳感器的生物識別界面，這樣有利于提高敏感界面的構建并提高檢測的綜合性能。電化學免疫傳感器是應用抗原－抗體的反應原理，結合抗原－抗體反應前后電化學響應信號的變化差異進行檢測目標抗原濃度的一種傳感器，具有可控、價廉以及靈敏度高的特點，被廣泛用于臨床蛋白質類標記物的檢測[7－10]。本實驗以實現快速、方便檢測胰腺癌及消化道惡性腫瘤的重要標志物CA19－9為目的，建立基于GO－ECR為抗體固定敏感界面的CA19－9檢測新方法。首先通過滴涂法將GO修飾于電極表面，再通過CV法聚合形成GO－ECR穩定電極修飾界面，然后采用碳二亞胺交聯法共價鍵合固定Anti－CA19－9；根據抗原－抗體反應的特點，一定濃度的CA19－9能夠特異、定比例地與抗體反應并固定在電極表面。由于CA19－9屬于非導電性的蛋白質大分子，在檢測溶液中對鐵氰化鉀離子在修飾電極表面的傳遞具有阻礙作用，使得電極表面固定CA19－9之后，響應電流明顯降低。通過電流的降低幅度可以對CA19－9定量而實現高靈敏檢測。本方法具有響應快、操作便捷的特點。

原子力顯微鏡是利用樣品表面與微尺度力敏感元件之間的極微弱的相互作用力而實現物質表面結構及性質的表征，可以觀察傳感器制備過程其表面的變化。通常情況下，未做任何修飾的GCE表面光滑平整，電化學聚合制備ECR－GO修飾的GCE表面出現分布均勻，粒徑為30nm左右的粗糙小突起；進一步共價鍵合固定CA19－9抗體以后，原先均勻的小顆粒突起轉變成簇狀、高度起伏較大的突起，呈現生物大分子聚集的現象，表明CA19－9抗體修飾電極表面的成功固定[11－12]，而且顯著的形貌變化說明電極表面固定了足量的抗體，有利于提高檢測CA19－9的靈敏度。

采用CV法和DPV法，選用鐵氰化鉀電對作為電化學探針對免疫傳感器的制作過程及其表面的變化進行考察。對比修飾電極不同步驟在鐵氰化鉀電對中的CV掃描圖。在GCE表面依次修飾GO和聚合ECR后，CV曲線中的氧化還原電流依次明顯減小，這是由于制備的GO和聚合在GO表面ECR導電性不好[13]，對[Fe（CN）6]3－／4－在修飾電極表面的傳遞具有一定的阻礙作用，表明GO和ECR依次被成功地修飾于電極表面。可能是由于CA19－9抗體具有較高的等電點，在修飾電極表面固定抗體后，CA19－9抗體帶正電，促進負電荷的[Fe（CN）6]3－／4－傳遞，CV曲線的氧化還原峰電流增大，抗體固定前后修飾電極響應電流的變化說明了抗體的固定成功。用BSA對固定抗體的修飾電極封閉，由于BSA屬于非導電性的蛋白質大分子，加上BSA的等電點為4.7，在溶液中帶負電，顯著排斥負電性的[Fe（CN）6]3－／4－傳遞，使得CV曲線的氧化還原峰電流降低。一定濃度的CA19－9與修飾電極反應之后，CV曲線的氧化還原峰電流明顯減小，表明檢測液中的CA19－9與修飾電極表面的抗體成功進行免疫反應，形成抗原抗體對而固定在修飾電極表面。通過在[Fe（CN）6]3－／4－溶液中掃描傳感器不同步驟的DPV圖得到電極表面的氧化響應電流，其氧化峰電流變化趨勢與CV圖的氧化還原峰的變化一致，而且由于DPV的氧化峰電流值變化較明顯，因此選擇CA19－9與修飾電極進行免疫反應前后的氧化峰ΔI定量分析CA19－9。

免疫傳感器的選擇性決定了對實際血清樣品中CA19－9的檢測能力，需要討論傳感器的特異性。在相同實驗條件下，用所制備的免疫傳感器檢測相似濃度的血清中常見蛋白質標志物，包括胰蛋白酶、CEA、CA125、CA153、PSA 以及 AFP，結果顯示其他常見血清標志物的電流變化值明顯小于相同濃度CA19－9的電流變化值，表明制備的免疫傳感器具有良好的特異性和選擇性，能夠用于復雜體系中CA19－9的檢測。在最佳實驗條件下用制備的傳感器測定不同濃度的CA19－9，隨著CA19－9濃度增大，DPV氧化峰電流逐漸降低，且抗原抗體固定前后的ΔI逐漸增大，說明了CA19－9濃度的變化能夠引起傳感器響應電流的敏感變化。CA19－9濃度在0.05～500U／mL范圍內，ΔI與 CA19－9濃度的對數值呈良好的線性關系，其線性方程可用于血清體系中檢測CA19－9的定量分析。而且本方法檢測CA19－9的檢測限（0.01U／mL）較低，與現有應用納米復合材料放大信號的三明治型電化學傳感器檢測CA19－9的相當[14]。應用所制備的傳感器檢測胰腺相關疾病的血清樣品中的CA19－9，檢測結果的RSD＜10%，而且檢測結果與臨床ECL檢測結果的相對偏差的絕對值也＜10%，表明本方法檢測臨床血清樣品中CA19－9的結果具有良好的準確度和精密度，具有較好的實用性，為用于臨床檢測CA19－9提供了可能。與臨床ECL比較，本研究構建的基于GO－ECR的免疫傳感器檢測CA19－9具有操作簡便、靈敏度高和成本低廉等優點，為其進一步用于臨床檢驗提供了良好的研究基礎。

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