重組原核表達載體pGEX6P1－Osx的構建與表達

王 鋒，陳 碩，王 瑋

2.美國德克薩斯州大學 圣安東尼奧健康科學中心牙學院發育牙科系，德克薩斯州 78229

成骨細胞特異性轉錄因子（osterix，Osx）是一種與骨形成及牙發育相關的轉錄因子[1－3]，近來研究表明，Osx可能為骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）所介導的成牙本質細胞分化過程中一個重要的信號分子，尋找與Osx相互作用的其他信號分子或蛋白質因子對闡明BMP2介導成牙本質細胞分化的分子機制具有重大意義。本研究旨在通過重組DNA技術，構建原核表達載體pGEX6P1－Osx，并利用原核蛋白表達與純化技術獲得谷胱甘肽巰基轉移酶（glutathione S－transferase，GST）－Osx融合蛋白，為后續 GST pull－down實驗篩選與Osx相互作用的蛋白質提供充足的誘餌蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）細菌與載體：大腸桿菌 DH5α、BL21由本實驗室保存；PCR－TopoII質粒（美國Invitrogen公 司），pGEX6P 系 列 載 體 （美 國Amersham公司）。（2）主要試劑：Trizol Reagent、SuperScript?Ⅱ 逆轉錄酶、1kb plus DNA Ladder（美國Invitrogen公司）；REDTaq?DNA Polymerase（美國 Sigma公司）；QIAquick?PCR Purification Kit、QIAquick?Gel Extraction Kit、QIAGEN Plasmid Mini Kit（德國Qiagen公司）；LB培養基（美國Sigma公司）；限制性內切酶EcoRI、XhoI（美國Invitrogen公司）；T4DNA連接酶（日本Takara公司）；氨芐青霉素（Amp）；以異丙基－β－D－硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）、谷胱甘肽瓊脂糖、還原型谷胱甘肽、考馬斯亮藍 R250、SDS、Tris、溶菌酶（美國Sigma公司）；小鼠抗GST抗體、兔抗Osx抗體（美國Santa Cruz公司）。

1.2 方法

1.2.1 牙髓組織總RNA提取 取新生1～2d小鼠上、下頜磨牙，置研缽中，倒入少量液氮，迅速研磨；隨后加入1mL Trizol試劑，按Invitrogen公司操作說明以酚氯仿萃取總RNA。所得RNA樣品經DNaseⅠ處理、Rneasy Mini Kit過柱純化后，以紫外分光光度計檢測RNA樣品濃度。

1.2.2 引物設計 參照GeneBank中小鼠Osx核苷酸序列，利用Primer 5.0設計擴增Osx mRNA全長片段的PCR引物，并在上、下游引物的5’端分別引入EcoRI與XhoI的酶切位點，引物序列分別為：

1.2.3 逆轉錄合成cDNA第一鏈 取1μL（1μg）RNA模板，以OligodT18為逆轉錄引物，按Invitrogen SuperScript?Ⅱ 逆轉錄酶操作說明逆轉錄合成cDNA第一鏈；總反應體積20μL。

1.2.4 PCR擴增目的基因Osx 取2μL cDNA模板，以Red Taq酶為DNA聚合酶，PCR擴增目的基因Osx全長序列。PCR反應條件如下：95℃預變性4min；95℃變性30s→56℃退火45s→72℃延伸1min，循環35次；72℃持續延伸10min；4℃冷卻。總反應體積為20μL。

1.2.5 PCR產物的TA克隆 按Invitrogen Topo TA Cloning Kit操作說明，配置4μL新鮮PCR產物（以QIAquick?PCR Purification Kit過柱純化）、1μL Salt Solution及1μL Topo Vector的Topo TA克隆反應體系，室溫下孵育5min，置冰上冷卻；加2～4μL Topo克隆反應產物至One Shot Chemically CompetentE.coli，輕觸管底混勻，冰上放置30min；42℃熱休克1min；迅速轉移至冰上冷卻2min；加入250μL SOC培養基，37 ℃，200r／min水平振蕩1h；取100μL轉化菌液涂板[Amp抗性LB平板，X－gal（＋），IPTG（＋）]，37 ℃過夜培養至藍白克隆形成；挑取白色陽性克隆菌落，擴增培養后小提質粒酶切鑒定并進一步測序。

1.2.6 pGEX6P1－Osx 重 組 質 粒 的 構 建 以EcoRI、XhoI雙酶切PCR－TopoII－Osx克隆質粒，切膠回收目的基因片段Osx；使用相同內切酶使pGEX6P1表達載體線性化；按10∶1物質的量比混合目的基因片段Osx與線性化pGEX6P1表達載體，以T4DNA Ligase為連接酶，配制10μL連接反應體系，16℃連接過夜；取6μL連接產物轉化DH5α感受態大腸桿菌，步驟同1.2.5；取100μL轉化菌液涂板，37℃過夜培養；挑取克隆菌落，擴增培養并小提質粒；酶切篩選陽性質粒并測序鑒定。

1.2.7 Osx重組原核蛋白的誘導表達 取1μL測序鑒定正確之重組質粒pGEX6P1－Osx，轉化至50μL大腸桿菌BL21，步驟同1.2.6；取少量菌液劃板培養至克隆形成，隨機挑取1個克隆，加入2mL LB培養基[Amp（＋），100μg／mL]，37℃、200r／min振蕩培養8h；吸取200μL菌液，按1∶100比例加入20mL LB培養基中繼續擴大培養；至菌液吸光度值（OD600nm）達0.4～0.6后，加入終濃度為1mmol／L的IPTG，于16℃、100r／min分別誘導培養4，6，8，12h，并設立對照；各時間點采集各樣本菌液（1mL），離心，棄上清，加入等體積2×SDS Loading Buffer，100℃煮沸變性5min，至冰上冷卻；取15μL樣本行SDS－PAGE電泳；考馬斯亮藍染膠、脫色、干膠儀干膠。

1.2.8 Osx重組原核蛋白的純化 將重組質粒pGEX6P1－Osx轉化至BL21，激活Amp抗性后取少量菌液劃板培養至克隆形成，隨機挑取單個克隆入LB培養基，37℃過夜振蕩培養；按1∶100體積比繼續擴大培養，至菌液OD600nm達0.4～0.6，加入終濃度為1mmol／L的IPTG，16 ℃、100r／min培養4h。4℃離心，棄上清，以10mL Lysis Buffer（50mmol／L Tris－Hcl，5mmol／L EDTA，50mmol／L KCl，1mmol／L DTT，1mmol／L PMSF，0.1%Triton X－100，1mg／mL溶菌酶）裂解菌淀，冰上孵育30min；超聲破碎4min；離心（4 ℃，12 000r／min，15min）獲取上清（內含可溶性外源蛋白），加入20mg谷胱甘肽瓊脂糖，4℃旋轉搖床孵育過夜；次日以緩沖液Ⅰ（50mmol／L Hepes緩沖液）洗滌結合GST－Osx融合蛋白的谷胱甘肽瓊脂糖凝膠，10min×3；最后以緩沖液Ⅱ（5mmol／L還原型谷胱甘肽）洗脫GST－Osx融合蛋白，取洗脫前及洗脫后的靶蛋白上清液各15μL煮沸變性后進行SDSPAGE電泳；考馬斯亮藍染膠、脫色、干膠儀干膠。

1.2.9 Western－blot鑒定純化重組蛋白 將洗脫的靶蛋白上清液煮沸變性后進行SDS－PAGE電泳，每孔上樣5μL；半干轉膜法（15V，2h）將靶蛋白轉印至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫封閉30min；加一抗（兔抗Osx抗體，小鼠抗GST抗體），4℃孵育過夜；TBST充分洗膜；加HRP標記的二抗（山羊抗兔IgG，山羊抗小鼠IgG）室溫孵育1h；TBST洗膜；加ECL孵育，暗室曝光、顯影、定影。

2 結 果

2.1 Osx基因的PCR擴增 以牙髓組織總RNA逆轉錄生成的Osx cDNA第一鏈為模板，用特異性引物進行PCR擴增，產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，擴增出的片段約在1.3kb處形成單一的條帶（圖1），與預期片段大小一致。

圖1 Osx PCR電泳圖Fig 1 PCR amplication of the target gene

2.2 重組PCR－TopoII－Osx的鑒定 將目的基因PCR產物與T載體（PCR－TopoII）的連接產物轉化至 DH5α（one shot chemically competentE.coli），通過含50μg／mL Amp的LB平板藍白篩選陽性克隆，隨機挑取白色菌落擴增培養并小提質粒，以EcoRI、XhoI酶切鑒定。由于線性PCR－TopoII T載體的大小約為4kb，目的基因約1.3kb，重組質粒的理論長度約為5.3kb，酶切獲得2條正確的目的條帶（圖2），表明重組質粒連接轉化成功。將重組質粒送UTHSCSA分子醫學檢測中心進行測序，測序結果與已知序列比對完全吻合，證明重組PCRTopoII－Osx構建成功。

圖2 TopoII－Osx酶切電泳圖Fig 2 Enzyme digestion of TopoII－Osx

2.3 重組pGEX6P1－Osx的鑒定 將表達質粒pGEX6P1與鑒定正確的重組子PCR－TopoII－Osx同時以EcoRI、XhoI雙酶切后，分別對載體與目的基因片段進行膠回收；各取5μL回收產物跑電泳檢測（圖3）；隨后將回收的載體與目的基因片段過夜連接并轉化至DH5α，進而篩選陽性克隆并小提質粒；以EcoRI或XhoI單酶切，可得到長約6kb的目的片段，與預期相符（目的基因理論長度1.3kb，pGEX6P1理論長度約4.9kb）；以EcoRI、XhoI進行雙酶切，則可獲得大小分別約為4.9kb與1.3kb的2個片段（圖4）。測序結果與已知序列比對相吻合，證明重組pGEX6P1－Osx構建成功。

圖3 膠回收DNA片段電泳圖Fig 3 DNA recycled from gel

2.4 Osx重組原核蛋白的誘導表達 含pGEX6P1－Osx的轉化菌BL21于16℃經IPTG誘導培養4，6，8，12h后分別采樣進行SDS－PAGE。重組菌泳道均可見增加一條約70kD的蛋白條帶，與融合蛋白的理論分子量吻合，但隨著誘導時間的延長蛋白表達量未見明顯增加，而作為對照的未誘導菌在此處則無誘導表達條帶（圖5）。

圖4 pGEX6P1－Osx雙酶切鑒定電泳圖Fig 4 Identification of recombinant plasmid by double enzyme digestion

圖5 原核表達產物SDS－PAGE電泳鑒定Fig 5 Identification of recombinant expressed protein by SDS－PAGE

2.5 Osx重組原核蛋白的純化 含pGEX6P1－Osx的轉化菌BL21置16℃冷房中以IPTG誘導培養4h，經菌體裂解、超聲破碎后離心獲得可溶性總蛋白上清；因融合蛋白表達GST標簽，故使用谷胱甘肽瓊脂糖樹脂特異性富集GST靶蛋白；洗脫后的靶蛋白經SDS－PAGE電泳，大約在70kD處可見一單一蛋白表達條帶（圖6），此即純化的GST融合蛋白。

2.6 純化重組蛋白的鑒定 免疫印跡結果顯示，以GST標簽抗體及Osx特異性抗體分別檢測純化的重組蛋白，均可見一大小約為70kD的陽性蛋白條帶（圖7），該條帶位置與GST－Osx的理論蛋白分子量吻合。

圖6 重組蛋白純化SDS－PAGE電泳鑒定Fig 6 Identification of purified recombinant protein by SDS－PAGE

圖7 Western－blot鑒定純化重組蛋白Fig 7 Identification of purified recombinant protein by Western－blot

3 討 論

Osx隸屬Sp／XKLF家族，主要表達于成骨細胞和成牙本質細胞，是骨形成與牙發育過程中所必須的轉錄因子[1－3]。體外實驗證實，前成牙本質細胞株iMDP3在BMP2刺激作用下，可促使Osx發生核轉位[4]，提示Osx可能為BMP2介導的信號通路的下游信號分子。BMP2條件性基因敲除后小鼠出現明顯異常的牙齒表型[5－6]，表明 BMP2在牙發育過程中具有不可或缺的作用。然而，BMP2經由何種信號轉導途徑調控牙本質發育的分子機制尚不明確；在BMP2介導的下游信號通路中，除Osx外，是否還存在能與其相互作用的其他信號分子亟待闡明。

GST pull－down實驗是一個行之有效的驗證酵母雙雜交系統的體外試驗技術，其基本原理是將靶蛋白－GST融合蛋白親和固化在谷胱甘肽親和樹脂上，作為與目的蛋白親和的支撐物，充當一種“誘餌蛋白”；當目的蛋白溶液過柱時，可從中捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白”（目的蛋白），洗脫結合物后通過SDS－PAGE電泳分析，從而證實2種蛋白間的相互作用或篩選相應的目的蛋白[7－8]。本研究旨在通過重組DNA技術，構建可表達GST－Osx融合蛋白的原核表達質粒，通過蛋白純化技術，最終獲得攜帶GST標簽的融合蛋白，為后續以GST pull－down實驗篩選能與Osx相互作用的可能的信號分子提供充足的“誘餌蛋白”。

pGEX表達系統是一種可以高效表達GST融合蛋白的系統[9－10]，考慮 Osx基因序列與載體上匹配的酶切位點，本研究選用pGEX6P1作為原核表達載體，且宿主細胞為E.coliBL21，后者是常用的原核表達宿主菌，為蛋白酶缺陷株，可使表達的目的蛋白免于降解。此外，選擇PCR－TopoII－vector作為中間載體，主要考慮利用Topo克隆技術可高效快速連接線性載體和目的基因片段的特點，以此構建PCR－TopoII－Osx克隆質粒；盡管Topo克隆為非定向克隆，經酶切鑒定插入片段大小正確的重組子尚不能排除反向連接的可能，但實驗中筆者在PCR引物5’端及3’端已分別引入EcoRI及XhoI的酶切位點，故以EcoRI與XhoI酶切重組Topo克隆獲得的目的基因Osx，可定向克隆至經相同酶切后回收的線性化載體pGEX6P1。定向克隆的重組子經酶切電泳獲得與載體及插入片段大小一致的電泳條帶，證明重組原核表達質粒pGEX6P1－Osx構建成功。

通過低溫培養和低速搖床來降低蛋白合成速度是有效提高E.coli表達系統重組蛋白可溶性的一個策略[9]，本研究發現，在溫度為16℃、搖床速度為100r／min的條件下，以1mmol／L的IPTG可有效誘導目的蛋白在宿主細胞BL21中表達，但進一步增加誘導時間并不能明顯增加目的蛋白的產出，提示該目的蛋白的可溶性在誘導表達4h后已達最大值。

盡管SDS－PAGE電泳結果表明，利用谷胱甘肽瓊脂糖樹脂可成功富集特異性GST融合蛋白，但尚不能證實該融合蛋白即為GST－Osx；Western－blot結果顯示，特異性抗體與標簽抗體的免疫反應陽性條帶處于同一位置，且與理論蛋白分子量大小一致，證明該純化的融合蛋白為GST－Osx。

綜上所述，利用pGEX表達系統，可有效獲得GST－Osx融合蛋白，純化后的融合蛋白則可進一步應用于篩選成牙本質細胞中潛在的能與Osx相互作用的其他未知蛋白質與信號分子。

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