基于定點突變改善中性植酸酶催化特性及結構-效應分析

王祖鵬，許 偉，邵 榮，韋 萍

（1.南京工業大學生物與制藥工程學院，江蘇 南京 211816；2.鹽城工學院海洋與生物工程學院，江蘇 鹽城 224051）

基于定點突變改善中性植酸酶催化特性及結構-效應分析

王祖鵬1,2，許 偉2，邵 榮2，韋 萍1,*

（1.南京工業大學生物與制藥工程學院，江蘇 南京 211816；2.鹽城工學院海洋與生物工程學院，江蘇 鹽城 224051）

對前期設計的來源于淀粉液化芽孢桿菌DSM 1061的3 種中性植酸酶突變體（D148E/H149R、Q67E/N68R、D191E）的穩定性及催化效率等進行研究，并對影響其性質的結構因素進行分析。結果表明：與野生酶相比，在85 ℃條件下，突變體D191E半衰期延長了4.3 min，但催化效率下降為野生酶的48.9%；突變體D1 48E/H149R催化效率為野生酶的229%，半衰期與野生酶基本一致；突變體Q67E/N68R催化效率為野生酶的93%，半衰期延長了0.7 min。圓二色光譜分析結果顯示，D148E/H149R催化效率提高最為顯著，α-螺旋含量由野生酶中11.79%降至2.90%，無規卷曲含量增加；Q67E/N68R性質與野生酶接近，其二級結構變化最?。籇191E催化效率降低，α-螺旋含量增加至24.59%。對野生酶和突變酶的同源模型分析發現，殘基D191具有較大的B因子值，不利于酶的熱穩定性，各突變殘基周圍的氫鍵有所變化。同源模型的分析也將為植酸酶的進一步改良提供理論依據。

中性植酸酶；定點突變；催化效率；圓二色光譜

植酸酶是一類能催化植酸鹽降解成肌醇和無機磷的酶的總稱[1]。植酸酶作為飼料添加劑，能夠提高植物性飼料中磷的利用率和單胃動物對礦質元素的吸收率，并能減少磷對環境的污染[2]。植酸酶來源廣泛，普遍存在于細菌[3-4]、真菌[5]以及動植物組織[6]中。目前商品化的植酸酶幾乎都是酸性植酸酶，然而酸性植酸酶僅適合胃中pH值呈酸性的單胃動物以及少數魚類如虹鱒等，不適用于我國水產養殖量最大的消化道為中性的鯉科魚類[7]。來源于芽孢桿菌的中性植酸酶屬于3-植酸酶（EC 3.1.3.8）和β-螺旋槳植酸酶[8- 9]，其具有最適pH值接近中性、酶活性高、熱穩定性好[10]等特性，可廣泛應用于魚類飼料。

近年來，中性植酸酶基因工程菌的構建及其活性的提高成為廣大科研人員關注的熱點。有學者成功將芽孢桿菌植酸酶基因在大腸桿菌中表達，但存在重組酶活性偏低等問題[11-12]。利用生物信息學對現有的大量酶進行統計分析，結合定點突變等分子生物學技術，對現有的酶進行設計改造，可以使其具有預期的優良性質[13-14]。不少學者利用這些手段對植酸酶的構象和催化機理進行研究，Osman等[15]利用同源建模結合定點突變的方法證實了Y78位于芽孢桿菌（Bacillus sp.）植酸酶的催化活性中心。Zeng Yifang等[16]利用晶體模型闡述了Bacillus植酸酶與二價金屬離子復合并與底物結合催化的機理。酶的熱穩定性是酶的重要性質之一，熱穩定性的增加能拓寬酶的應用范圍[17]，將這些手段相結合能較快獲得兼具高活力和熱穩定性的中性植酸酶。在中性植酸酶的分子改造方面，Oh等[18]對淀粉液化芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）DS11植酸酶進行了一系列的單點突變研究。結果發現突變酶D314A、E211A、E260A和Y159F喪失活性，其余幾種突變酶催化效率kcat/Km顯著下降，最高僅為野生酶的48.81%。Shim等[19]對來源于B. amyloliquefaciens DS11的植酸酶進行突變，但得到D56A、D56E、D308A、D308E等突變體的催化效率kcat/Km與野生酶相比均有所降低。

本實驗室前期已獲得來源于B. amyloliquefaciens DSM 1061的新型中性植酸酶基因[8]，并在大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中進行了高效表達[20]及定點突變研究，獲得3 種中性植酸酶突變體（D148E/H149R、Q67E/N68R和D191E）[21]。本研究對中性植酸酶3 種突變體的催化效率和熱穩定性進一步研究，通過圓二色光譜分析突變酶的結構變化，利用同源建模的方法探討可能影響酶熱穩定性的因素，對突變部位的氫鍵及突變殘基的B因子進行分析，為后期酶學性質的進一步改良提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與培養基

重組E. coli BL21（DE3）/pET22b（+）-phyc菌株為鹽城工學院生物實驗室構建并保存。

LB培養基：酵母膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 10 g、121 ℃條件下高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.2 試劑

植酸鈉、蛋白Marker 生工生物工程（上海）股份有限公司；酵母膏、蛋白胨 英國Oxoid公司；考馬斯亮藍G250、考馬斯亮藍R250、咪唑、三羥甲基氨基甲烷（Tris） 國藥集團藥業股份有限公司；蛋白純化試劑盒 北京康為世紀生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV752N紫外-可見分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司；CT15RT高速冷凍離心機 上海天美生化儀器設備工程有限公司；DYY-8C垂直電泳儀 北京六一儀器廠；J-810型圓二色光譜儀 日本Jasco公司。

1.3 方法

1.3.1 中性植酸酶的誘導表達

將保存于－80 ℃的3 種含中性植酸酶突變基因的菌株及原始菌株在含氨芐（終質量濃度100 μg/mL）的LB平板劃線，置于37 ℃的培養箱中倒置培養。挑取原始菌株及突變菌分別轉接到新鮮的LB液體培養基中，在37 ℃條件下，180 r/min振蕩培養至對數生長期（OD600 nm≈0.6～0.8），分別加入誘導劑異丙基硫代半乳糖苷（終濃度1.0 mmol/L），置于20 ℃條件下，180 r/min誘導表達6 h。取適量誘導后的培養液，8 000 r/min離心15 min收集菌體，用無菌水洗滌2 次后，菌體重懸于0.5 mL（pH 7.0，50 mmol/L）Tris-HCl緩沖液中，超聲波破碎菌體細胞。破胞條件為：超聲功率400 W，工作時間3 s，間歇3 s，在冰浴環境中循環200 次。將超聲破碎后的樣品在12 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，取上清即為粗酶液。

1.3.2 突變酶的純化

蛋白質純化采用Ni-Agarose 6×His標簽蛋白純化試劑盒在4 ℃條件下進行純化。純化步驟如下：用10 倍體積平衡液（20 mmol/L咪唑、50 mmol/L Tris、500 mmol/L NaCl）平衡層析柱，平衡結束后將粗酶液上樣，進樣速率為0.25 mL/min。上樣結束后，用平衡液洗去雜蛋白，再用洗脫液（500 mmol/L咪唑、50 mmol/L Tris、500 mmol/L NaCl）洗下目的蛋白，純化效果利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）檢測。將含目的蛋白的洗脫液置透析袋（截留分子質量8～14 kD）中透析除鹽。

1.3.3 中性植酸酶酶學性質測定

中性植酸酶的酶活力測定方法參考GB/T 18634-2009《飼用植酸酶活性的測定 分光光度法》，并稍作修改。植酸鈉終濃度為5.0 mmol/L，反應體系CaCl2的終濃度為2 mmol/L，緩沖體系為Tris-HCl緩沖液（0.25 mol/L，pH 7.0）。取0.2 mL酶液與上述底物混合，反應總體積6 mL。將上述混合物置于37 ℃條件下反應30 min，加入4 mL顯色及終止液終止反應，于415 nm波長處測定無機磷的含量。

酶活力單位（U）定義：在一定條件下，每分鐘釋放出1 μmol無機磷所需的酶量為一個酶活力單位。

1.3.3.1 中性植酸酶動力學常數的測定

反應體系中采用不同的底物濃度，使其終濃度分別為0.125、0.25、0.5、1、2、4 mmol/L。置于酶的最適溫度和pH值條件下水浴反應30 min，加入4 mL顯色及終止液終止反應，測定酶活力，以雙倒數作圖法確定Km和vmax，并根據酶濃度計算催化常數kcat，進一步求得催化效率kcat/Km[21]。

1.3.3.2 中性植酸酶半衰期測定

半衰期是指特定溫度下酶活力喪失一半的時間，是表征酶熱穩定性的一個重要參數。將野生酶和突變酶在85 ℃條件下分別保溫0、2、4、6、8、10 min后37 ℃條件下測定酶活力，得出酶活力下降至50%時所對應的保溫時間。

1.3.4 中性植酸酶的圓二色光譜掃描

將野生酶與突變酶的濃度調成一致，酶溶液中含有終濃度為2 mmol/L的Ca2+。利用圓二色光譜儀在200～240 nm范圍內掃描，測定幾種中性植酸酶突變體的圓二色性。

2 結果與分析

2.1 中性植酸酶的SDS-PAGE分析

圖1 植酸酶的SDS-PAGGEE圖Fig.1 SDS-PAGE of mutant phytases

對大腸桿菌中表達的中性植酸酶突變酶蛋白純化后進行SDS-PAGE檢測，如圖1所示，結果表明經過鎳柱純化后獲得單一條帶，即為均一的植酸酶蛋白，已達到電泳純。突變酶分子質量與野生酶一致[20]，約為42 kD。

2.2 中性植酸酶動力學參數

運用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法，繪制野生酶及突變酶的動力學曲線，通過方程求得植酸酶的動力學常數。再根據vmax=kcat[E]計算催化常數kcat，進一步計算催化效率kcat/Km。表1列出了野生酶和突變酶的米氏常數、最大反應速率等動力學參數。與野生酶相比，D148E/H149R的最大反應速率vmax提高了62%，其催化效率提高最為顯著，為野生酶的229%。D148E/H149R的米氏常數Km變化不明顯，只降低了5%，但其催化效率有大幅提高，推測這與最大反應速率的提高有關。Q67E/N68R的最大反應速率比野生酶下降了11.8%，催化效率為野生酶的93.0%。D191E的最大反應速率下降為野生酶的51.3%，催化效率降低明顯，僅為野生酶的48.9%。Oh等[18]對來源于B. amyloliquefaciens DS11的植酸酶進行研究，獲得的突變體R122E催化效率僅為野生酶的48.81%。Shim等[19]得到的突變體催化效率也普遍降低，突變體D308E催化效率最高，也僅為野生酶的94.04%。與之相比，本課題組獲得的突變體D148E/H149R催化效率提高幅度更為顯著。Tran等[22]對來源于Bacillus sp. MD2的堿性植酸酶突變，獲得的突變體E229V的最高活力達到37.8 U/mg，與本研究所得到的突變體D148E/H149最高反應速率32.19 U/mg接近。

表1 植酸酶的動力學參數Table 1 Kinetic parameters of mutant phytases

2.3 中性植酸酶半衰期

在特定的條件下，酶的半衰期越長，說明酶的穩定性越好。在含有2 mmol/L Ca2+的環境中，85 ℃條件下保溫不同時間，酶活力殘留曲線如圖2所示，突變體D148E/H149R、Q67E/N68R 與野生酶變化趨勢接近，而D191E酶活力下降緩慢。野生酶的半衰期為3.5 min，D148E/H149R的半衰期與野生酶接近，為3.6 min，Q67E/N68R的半衰期為4.2 min；D191E的半衰期最長，為7.8 min。與野生酶相比，D191E的半衰期延長了4.3 min，熱穩定性顯著提高。Yao Mingze等[23]得到的來源于大腸桿菌的植酸酶，在85 ℃條件下處理，酶的剩余活力下降顯著，最終穩定在20%左右，本課題組獲得的突變體D148E/H149R、Q67E/N68R以及野生酶的變化與之相似，而D191E顯示出較好的熱穩定性。

圖2 植酸酶的熱穩定曲線Fig.2 Thermal inactivation curves of mutant phytases

2.4 中性植酸酶的圓二色光譜

圓二色光譜是研究稀溶液中蛋白質構象的一種快速、簡單、較準確的方法，已受到研究者的廣泛關注[24]。如張耀華等[25]利用圓二色光譜研究了pH值對植酸酶穩定性的影響，發現當溶液pH值由5變為8時，植酸酶二級結構變化較大，α-螺旋含量由84.27%變為29%。利用圓二色光譜分析蛋白質的二級結構可以發現突變酶和野生酶蛋白結構間的差異。野生酶及突變酶的圓二色光譜如圖3所示，D191E、D148E/H149R的圓二色光譜與野生酶相差較大，Q67E/N68R則與野生酶最為相近。利用CDPro軟件對數據進行處理，計算出野生酶及突變酶的各個二級結構的含量，如表2所示。野生酶α-螺旋的含量為11.79%，β-折疊含量為41.26%。圓二色光譜顯示酶的空間結構與酶的活力密切相關，D148E/H149R酶催化效率提高，α-螺旋含量降低至2.90%，無規卷曲含量增加；D191E催化效率降低，α-螺旋含量提高至24.59%；Q67E/N68R性質與野生酶接近，二級結構變化最小。Correia等[26]利用圓二色光譜分析溫度和溶劑對植酸酶穩定性的影響，當熱處理溫度由25 ℃升高至60 ℃，3-植酸酶α-螺旋含量由61.3%降至23.9%，6-植酸酶的α-螺旋含量由49.0%下降到15.9%，無規卷曲含量均增加。本研究中，突變酶二級結構的改變可能是由于突變后的氨基酸改變影響了原有酶蛋白α-螺旋等結構的形成，其中D148E/H149R中α-螺旋的含量減少，無規卷曲的含量增加，使得酶分子柔性增加，利于酶與底物的結合，獲得更高的催化效率；而D191E則相反，α-螺旋含量的增加可能提高了酶的剛性，使得酶熱穩定性提高，與文獻[26]報道相吻合。

圖3 植酸酶的圓二色光譜Fig.3 Circular dichroism of mutant phytases

表2 植酸酶的二級結構含量Table 2 Secondary structure contents of phytases determined by CD spectroscopy%

2.5 突變殘基部位氫鍵的變化

穩定蛋白質三維結構的作用力主要是一些非共價鍵或次級鍵包括氫鍵、范德華力、疏水作用、鹽鍵等。其中氫鍵是使酶蛋白高級結構穩定的重要作用力[27]。利用SWISS-MODEL服務器，對刪除信號肽的野生酶和突變酶進行同源建模，利用軟件Swiss-PdbViewer 4.10對突變酶的同源模型進行分析，統計氨基酸殘基5 ?半徑內突變前后氫鍵的變化。如表3和圖4所示，突變后氨基酸殘基周圍的氫鍵數目及位置有所變化。通過同源模型觀察到突變后E191殘基的OE2能與N193殘基的ND2間形成氫鍵，研究也證實，將D191殘基突變成谷氨酸之后，酶的熱穩定性顯著增加，推斷這樣形成的氫鍵能有效地增加酶分子表面的剛性，從而增加酶的穩定性[27]。與野生酶相比，突變體Q67E/N68R的氫鍵數目有所增加，發現將N68殘基突變為精氨酸后，其能與D62形成2個氫鍵。結果表明，Q67E/N68R穩定性略有提高，推測這與氫鍵數目的增加有關。突變體D148E/H149R與野生酶相比，5?的半徑內氫鍵增加了2個，將H149殘基突變成R149之后能夠與D191殘基間形成氫鍵，氫鍵數目也有所增加，但熱穩定性的提高并不明顯。

表3 突變殘基的氫鍵變化統計Table 3 Hydrogen bond number around mutation residues of phytases

圖4 突變前后殘基氫鍵的變化Fig.4 Changes of hydrogen bonds before and after the mutation of phytases

2.6 突變殘基的B因子值分析

B因子值體現了晶體中原子電子密度的“模糊度”，即蛋白質分子在晶體中的構象狀態。B因子值越高，“模糊度”越大，相應部位的構象就越不穩定[28]，對蛋白質的穩定性影響越大?？梢愿鶕﨎因子值來分析穩定性。Reetz等[29]根據測定各個氨基酸殘基的B因子值選擇不利于蛋白質穩定的氨基酸殘基進行突變來提高酶的熱穩定性。利用網站服務器（http://spinportal.magnet.fsu. edu/bfactors/）對中性植酸酶各個氨基酸的B因子值進行預測。所選突變氨基酸的B因子值如表4所示。D191殘基的B因子值最高，說明D191殘基所處部位最不穩定，理論上對植酸酶的熱穩定性影響最大。結果也證實，在這些突變殘基中，D191殘基對植酸酶的熱穩定性影響最大，將D191這一氨基酸殘基突變后得到的D191E熱穩定性大幅提高。而H149、N68等氨基酸殘基的B因子值相對較小，說明其構象穩定，對酶的熱穩定性影響不大，D148E/H149R、Q67E/N68R這兩個突變體熱穩定性改善不是很明顯。

表4 植酸酶殘基的B因子值Table 4 B-factor values of amino acid residues in phytases

2.7 突變體結構與功能關系分析

突變體D148E/H149R、Q67E/N68R、D191E位于酶分子的表面，未對植酸酶的保守序列進行改變，避免了對活性中心改變而造成的酶催化活力的喪失。酶活力和穩定性通常存在著一種平衡[30]，突變后酶活力的提高往往造成穩定性的下降，與之類似，本研究中突變體D148E/H149R催化效率是野生酶的2.29 倍，但半衰期與野生酶相近；與野生酶相比，突變體D191E穩定性大幅度提高，但催化效率卻顯著下降。從其結構模型可以看出，D191殘基位于蛋白質的Loop環上，谷氨酸代替天冬氨酸之后擁有更大的側鏈，同時能和N193殘基的ND2形成氫鍵，推測這增加了酶蛋白表面的剛性。研究顯示β-螺旋植酸酶分子酶的活性中心比較狹窄[31]，D191殘基這一改變可能影響到了酶活力中心與底物的結合，從而使得其催化效率降低明顯。通常情況下氫鍵的數目增加后，酶的穩定性會提高，但氫鍵只是影響酶結構穩定性的因素之一，如D191殘基突變后，在氫鍵數目未增加的情況下，穩定性卻大幅提高，說明還存在其他諸多因素影響著蛋白質的穩定性，在今后的研究中，將進一步探索使得突變體穩定性大幅提升的原因。另外D191殘基的B因子值比較大，說明了D191構象的不穩定，突變后其熱穩定性得到大幅度提高。圓二色光譜顯示D191E的α-螺旋結構含量明顯增加，這使得酶表面的剛性增加，也與熱穩定性的提高有關。D148、H149是位于酶表面的非保守氨基酸，圓二色光譜顯示D148E/H149R的α-螺旋含量降低最顯著，無規卷曲含量明顯增加，可能使得酶柔性增加，能更好地與底物結合，從而提高催化效率。Q67、N68同樣是位于酶表面的非保守氨基酸，突變體Q67E/N68R的二級結構與野生酶相似，α-螺旋等結構含量未發生明顯改變。

3 結 論

獲得的突變體D148E/H149R的最大反應速率vmax提高了62%，催化效率為野生酶的229%，提高了植酸酶的利用率。Q67E/N68R催化效率是野生酶的93.0%，半衰期延長了0.7 min，性質改變不明顯。85 ℃條件下D191E的半衰期比野生酶延長了4.3 min，能更好地避免因高溫而造成的酶活力損失。圓二色光譜顯示突變酶之間結構存在差異，與野生酶相比，D148E/H149R的α-螺旋含量降低，無規卷曲含量增加。同源模型結構顯示，突變殘基周圍氫鍵數目和位置均有所改變，對突變殘基的B因子值進行分析，發現D191的B因子值較高，D191E熱穩定性的提高與不穩定殘基D191的突變有關。研究中所獲得的突變體多數是在單一方面性能的大幅改善，要獲得高催化效率及熱穩定性優良的植酸酶需要經過多次突變和反復地篩選，酶分子同源模型的構建也為后期對酶學性質的進一步改良提供依據。

[1] SINGH B, KUNZE G, SATYANARAYANA T. Developments in biochemical aspects and biotechnological applications of microbial phytases[J]. Biotechnology and Molecular Biology Review, 2011, 6(3): 69-87.

[2] 許偉, 邵榮, 余曉紅, 等. 中性植酸酶結構與功能關系研究進展[J].鹽城工學院學報: 自然科學版, 2010, 23(4): 9-12.

[3] BAWANE R, TANTWAI K, RAJPUT L P S, et al. Molecular analysis of phytase gene cloned from Bacillus subtilis[J]. Advanced Studies in Biology, 2011, 3(3): 103-110.

[4] PANDEE P, SUMMPUNN P, WIYAKRUTTA S, et al. A thermostable phytase from Neosartorya spinosa BCC 41923 and its expression in Pichia pastoris[J]. Journal of Microbiology, 2011, 49(2): 257-264.

[5] BHAVSAR K, BUDDHIWANT P, SONI S K, et al. Phytase isozymes from Aspergillus niger NCIM 563 under solid state fermentation: biochemical characterization and their correlation with submerged phytases[J]. Process Biochemistry, 2013, 48(11): 1618-1625.

[6] 馬璽, 趙玉華, 單安山. 麥類籽實中植酸酶的活性及體外降解植酸鹽效果的研究[J]. 中國飼料, 2007(16): 13-16.

[7] 許偉, 仇明, 余曉紅, 等. 芽孢桿菌植酸酶基因的克隆及生物信息學分析[J]. 食品科學, 2011, 32(7): 202-206.

[8] 李曉龍, 楊合同, 扈進冬, 等. 植酸酶的多樣性及其分類[J]. 微生物學通報, 2010, 37(5): 738-747.

[9] 吳琪，王紅寧, 劉世貴.芽孢桿菌植酸酶分子生物學研究進展[J].中國生物工程雜志, 2005(B04): 180-185.

[10] IGBASAN F A, M?NNER K, MIKSCH G, et al. Comparative studies on the in vitro properties of phytases from various microbial origins[J]. Archives of Animal Nutrition, 2000, 53(4): 353-373.

[11] 陳艷, 孫建義, 趙學新, 等. Bacillus amyloliquefaciens中性植酸酶基因的原核表達及蛋白純化和性質[J]. 食品與生物技術學報, 2005, 24(2): 60-65.

[12] RAO D E, RAO K V, REDDY V D. Cloning and expression of Bacillus phytase gene (phy) in Escherichia coli and recovery of active enzyme from the inclusion bodies[J]. Journal of Applied Microbiology, 2008, 105(3): 1128-1137.

[13] 陳文聰, 胡朝暉, 朱慶義. 生物信息學的進展及其在分子微生物學研究中的應用[J]. 分子診斷與治療雜志, 2011, 3(3): 207-211.

[14] 丁彥蕊,蔡宇杰, 須文波. 用同源建模法探索提高脂肪酶的耐熱性[J].計算機與應用化學, 2007, 24(11): 1535-1538.

[15] OSMAN A A, BABU P R, VENU K. Prediction of substrate-binding site and elucidation of catalytic residue of a phytase from Bacillus sp.[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2012, 51(1): 35-39.

[16] ZENG Yifang, KO T P, LAI Huilin, et al. Crystal structures of Bacillus alkaline phytase in complex with divalent metal ions and inositol hexasulfate[J]. Journal of Molecular Biology, 2011, 409(2): 214-224.

[17] RATHI P C, RADESTOCK S, GOHLKE H. Thermostabilizing mut ations preferentially occur at structural weak spots with a high mutation ratio[J]. Journal of Biotechnology, 2012, 159(3): 135-144.

[18] OH B C, CHANG B S, PARK K H, et al. Calcium-dependent catalytic activity of a novel phytase from Bacillus amyloliquefaciens DS11[J]. Biochemistry, 2001, 40(32): 9669-9676.

[19] SHIM J, OH B C. Characterization and application of calciumdependent β-propeller phytase from Bacillus amyloliquefaciens DS11[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60(30): 7532-7537.

[20] 路國偉, 許偉, 邵榮, 等. 新型中性植酸酶在大腸桿菌中的高效表達、純化及酶學性質[J]. 食品科學, 2012, 33(21): 153-156.

[21] XU Wei, WANG Zupeng, SHAO Rong. Site-directed mutagenesis of a neutral phytase from Bacillus amyloliquefaciens: infl uencing activity and stability[C]// Advanced Materials Research, Switzerland: Trans Tech Publications, 2014: 271-278.

[22] TRAN T T, MAMO G, BUXO L, et al. Site-directed mutagenesis of an alkaline phytase: influencing specificity, activity and stability in acidic milieu[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2011, 49(2): 177-182.

[23] YAO Mingze, WANG Xi, WANG Wei, et al. Improving the thermostability of Escherichia coli phytase, AppA, by enhancement of glycosylation[J]. Biotechnology Letters, 2013, 35(10): 1669-1676.

[24] 沈瓊, 黃濱, 邵嘉亮, 等. 運用圓二色譜研究酶與化合物相互作用的機理[J]. 中山大學學報: 自然科學版, 2006, 45(4): 62-64.

[25] 張耀華, 姚明澤, 盧文亮, 等. 大腸桿菌植酸酶在畢赤酵母中的表達與純化[J]. 應用與環境生物學報, 2012, 18(4): 678-681.

[26] CORREIA I, AKSU S, ADAO P, et al. Vanadate substituted phytase: immobilization, structural characterization and performance for sulfoxidations[J]. Journal of Inorganic Biochemistry, 2008, 102(2): 318-329.

[27] 陳惠, 王紅寧, 楊婉身. F43Y及I354 M, L358F定點突變對植酸酶熱穩定性及酶活性的改善[J]. 中國生物化學與分子生物學報, 2005, 21(4): 516-520.

[28] 張海龍, 宋時英, 林政炯. 酶活性部位關鍵殘基的晶體學溫度因子[J].中國科學: C輯, 1999, 29(1): 9-16.

[29] REETZ M T, SONI P, FERNANDEZ L. Knowledge-guided laboratory evolution of protein thermolability[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2009, 102(6): 1712-1727.

[30] YASUKAWA K, INOUYE K. Improving the activity and stability of thermolysin by site-directed mutagenesis[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics, 2007, 1774(10): 1281-1288.

[31] SHIN S, HA N C, OH B C, et al. Enzyme mechanism and catalytic property of propeller phytase[J]. Structure, 2001, 9(9): 851-858.

Improvement of Catalytic Properties and Structure-Activity Relationship of Neutral Phytase Based on Site-Directed Mutagenesis

WANG Zupeng1,2, XU Wei2, SHAO Rong2, WEI Ping1,*
(1. College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing Tech University, Nanjing 211816, China; 2. School of Marine and Biological Engineering, Yancheng Institute of Technology, Yancheng 224051, China)

Three mu tations (D148E/H149R, Q67E/N68R and D191E) of neutral phytase from Bacillus amyloliquefaciens DSM 1061 have designed in our previous study. Enzymatic properties such as thermostability and catalytic effi ciency were studied in this paper. The structural changes were analyzed to explore the relationship with properties of mutant phytases. The results showed that the half-life of D191E was 4.3 min longer than that of wild-type phytase at 85 ℃, but its catalytic effi ciency reduced to 48.9% of wild-type phytase. The catalytic effi ciency of mutant D148E/H149R was increased to 229% of wild-type phytase although the half-life was similar. The catalytic efficiency of Q67E/N68R was 93% of wild-type phytase and the half-life was extended by 0.7 min. Circular dichroism showed that the catalytic effi ciency of D148E/H149R was improved most obviously while the content of α-helix decreased from 11.79% to 2.90%, and the content of random coil was increased. The structure of Q67E/N68R changed little and its properties were closed to those of wild-type phytase. The α-helical content of D191E increased to 24.59% while the catalytic effi ciency decreased a lot. Using homologous models to analyze the factors which may affect the thermal stability of phytases, we found that the B-factor value of D191 was high so that it was unfavorable to the stability of phytase. The hydrogen bonds around mutation residues also changed. Homologous model analysis will provide the theoretical basis for further study of phytase.

neutral phytase; site-directed mutagenesis; catalytic effi ciency; circular dichroism

Q55

A

1002-6630（2015）19-0118-06

10.7506/spkx1002-6630-201519021

2014-12-18

國家自然科學基金青年科學基金項目（31101912）；江蘇省自然科學基金項目（BK2011420）；江蘇省“青藍工程”項目

王祖鵬（1990-），男，碩士研究生，研究方向為酶工程。E-mail：wzp9012@163.com

*通信作者：韋萍（1961-），女，教授，博士，研究方向為生化工程。E-mail：weiping@njtech.edu.cn