Pseudomonas sp. W7產(chǎn)低溫蛋白酶培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化

康傳紅，田亞新，李秀涼，董義杰，原繼紅，王運(yùn)來(lái)，韓曉云,*

（1.黑龍江大學(xué)化學(xué)化工與材料學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150080；2.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150080）

Pseudomonas sp. W7產(chǎn)低溫蛋白酶培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化

康傳紅1，田亞新2，李秀涼2，董義杰2，原繼紅1，王運(yùn)來(lái)2，韓曉云2,*

（1.黑龍江大學(xué)化學(xué)化工與材料學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150080；2.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150080）

采用Plackett-Burman法對(duì)影響假單胞菌（Pseudomonas sp.）W7產(chǎn)低溫蛋白酶的因素進(jìn)行顯著性分析，篩選出對(duì)產(chǎn)酶影響顯著的3 個(gè)因素：葡萄糖、蛋白胨和MgSO4；然后用最陡爬坡試驗(yàn)逼近最大產(chǎn)酶區(qū)域；應(yīng)用Box-Behnken原理設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析確定產(chǎn)酶培養(yǎng)基的最佳組合為：葡萄糖4.25 g/L、蛋白胨7.00 g/L、干酪素4.00 g/L、K2HPO45.00 g/L、KH2PO41.00 g/L、CaCl20.26 g/L、MgSO40.14 g/L，低溫蛋白酶的酶活力達(dá)到了183.9 U/mL，比優(yōu)化前提高了21%。另外，對(duì)Pseudomonas sp. W7的產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，在單因素的基礎(chǔ)上，利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，最終確定產(chǎn)酶的最優(yōu)培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為20 ℃、初始pH值為7.0、接種量為3%、裝液量為20%、搖床轉(zhuǎn)速為100 r/min，在最佳條件時(shí)測(cè)得的酶活力為193.2 U/mL。通過(guò)生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酶曲線的測(cè)定，確定產(chǎn)酶的培養(yǎng)時(shí)間為48 h。

低溫蛋白酶；假單胞菌W7；培養(yǎng)條件優(yōu)化；響應(yīng)面分析

低溫微生物及其所產(chǎn)的極端酶類已成為國(guó)際研究的一個(gè)熱門(mén)領(lǐng)域[1-2]。低溫蛋白酶是低溫微生物分泌的催化肽鍵水解的一類酶，它的最適溫度一般在40 ℃以下，在低溫條件甚至0 ℃時(shí)都有一定的催化效率[3]。低溫蛋白酶大都是由低溫環(huán)境中的微生物在低溫脅迫的情況下為了適應(yīng)極端環(huán)境而產(chǎn)生的，例如兩極地區(qū)、冰窟、高山、深海和凍土等天然的低溫環(huán)境以及冰箱、冷庫(kù)等人為低溫環(huán)境中的微生物[4-5]。此外，也可從低溫植物和冷血?jiǎng)游锷戏蛛x到[6]。目前，研究比較深入的低溫蛋白酶大多數(shù)是從低溫微生物和適冷魚(yú)類體內(nèi)分離出來(lái)的，其中低溫微生物主要包括：真菌、細(xì)菌和酵母等。產(chǎn)低溫蛋白酶的細(xì)菌主要屬于Pseudomonas屬、Xanthomonas屬、Aeromonas屬和Colwellia屬等[7-8]。近年來(lái)，隨著全基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用以及各種低溫酶晶體結(jié)構(gòu)[9]的獲得，為進(jìn)一步探究極端環(huán)境微生物適應(yīng)機(jī)制和低溫酶的分子結(jié)構(gòu)奠定基礎(chǔ)[10]。低溫微生物在溫度比較低的環(huán)境中長(zhǎng)期進(jìn)化適應(yīng)，擁有了能夠在低溫條件下生存繁殖的結(jié)構(gòu)特征和生理生化機(jī)制，相應(yīng)地，由其產(chǎn)生的低溫蛋白酶也具有特殊的結(jié)構(gòu)和生理特性[11]，在食品[12-13]、化妝品[14-15]、洗滌[16-18]、污水處理等工業(yè)上有著中溫蛋白酶無(wú)法比擬的優(yōu)越性，在很多領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用潛力。

培養(yǎng)基的組成對(duì)低溫菌分泌蛋白酶影響比較明顯，尤其是碳源、氮源，研究快速利用碳源的阻遏作用和適合長(zhǎng)度多肽的誘導(dǎo)作用最為重要[19-20]。本研究是在前期單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化產(chǎn)酶培養(yǎng)基，并利用SAS軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，從而確定產(chǎn)酶培養(yǎng)基的最佳組成。另外，本研究在確定最佳培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)從培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基的初始pH值、接種量及裝液量等幾個(gè)方面對(duì)產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，以期獲得最佳培養(yǎng)條件，為后續(xù)科學(xué)研究和工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

假單胞菌（Pseudomonas sp.）W7，由黑龍江大學(xué)生物工程專業(yè)實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖5 g、蛋白胨10 g、酵母膏2 g、K2HPO45 g、KH2PO42 g、MgSO40.1 g、CaCl20.2 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2，115 ℃高壓滅菌30 min。

1.1.3 試劑

牛肉膏、蛋白胨 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；葡萄糖 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；干酪素 鄭州皇朝化工產(chǎn)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TU1810紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；雙人單面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；SPX-250B型生化培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；MLS-3020滅菌鍋 日本三洋公司；HZQ-F160振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；低溫高速離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶活力的測(cè)定

蛋白酶活性采用Folin-酚法測(cè)定[21]。用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）配制的2 g/100 mL酪蛋白為底物。用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）將酶液稀釋合適的倍數(shù)。取1 mL稀釋的酶液，在35 ℃條件下保溫1 min，加入同樣溫度的底物1 mL，在35 ℃條件下反應(yīng)10 min后，加入2 mL 0.4 mol/L的三氯乙酸終止反應(yīng)。在35 ℃保溫20 min后，12 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液加入5 mL 0.4 mol/L的碳酸鈉，混勻后加入1 mL的福林試劑，混勻后在35 ℃保溫20 min，然后用分光光度計(jì)測(cè)定660 nm波長(zhǎng)處的光密度（OD）值。以滅活的酶樣品為對(duì)照。標(biāo)準(zhǔn)曲線用不同濃度的酪氨酸來(lái)制定。酶活力單位（U）定義為在35 ℃條件下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸為1 個(gè)蛋白酶活力單位。

1.3.2 培養(yǎng)基優(yōu)化

以下培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)中，培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度20 ℃、接種量2%、裝液量28%、搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min。

1.3.2.1 Plackett-Burman試驗(yàn)[22]確定主要影響因素

對(duì)培養(yǎng)基每種成分選高低2個(gè)水平，其中高水平是低水平的1.5倍，以酶活力作為響應(yīng)值，從中篩選出對(duì)產(chǎn)酶影響顯著的培養(yǎng)基組分。試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素及水平如表1所示，每組試驗(yàn)有3個(gè)重復(fù)，取3組試驗(yàn)的平均值。分別計(jì)算各因素效應(yīng)，并進(jìn)行重要性評(píng)價(jià)。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels used in Plackett-Burman design

1.3.2.2 最陡爬坡法確定主要影響因素的水平

最陡爬坡法[23]以試驗(yàn)值變化的梯度方向?yàn)榕榔路较?，根?jù)各因素效應(yīng)值的大小確定變化的步長(zhǎng)，以酶活力為響應(yīng)值，從而找出各因素最大響應(yīng)區(qū)域。

1.3.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基最佳配比

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，采用三因素三水平的三元二次響應(yīng)面分析方法[24]，優(yōu)化產(chǎn)酶培養(yǎng)基。根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)的結(jié)果，自變量的試驗(yàn)水平分別以－1、0、1進(jìn)行編碼，共設(shè)計(jì)15 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中1～12為析因點(diǎn)；自變量取值在各因素所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)；13～15是零點(diǎn)，為區(qū)域的中心點(diǎn)，中心試驗(yàn)重復(fù)3 次來(lái)估計(jì)試驗(yàn)誤差。

1.3.3 產(chǎn)酶條件優(yōu)化

以下產(chǎn)酶條件優(yōu)化使用的培養(yǎng)基為優(yōu)化好的產(chǎn)酶培養(yǎng)基，除考察的特定條件變化外，其他培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)培養(yǎng)基pH 7.2、培養(yǎng)溫度20 ℃、接種量2%、裝液量28%、搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min。

1.3.3.1 培養(yǎng)溫度的優(yōu)化

將Pseudomonas sp. W7接種到優(yōu)化好的產(chǎn)酶培養(yǎng)基上，分別在10、15、20、25、30 ℃培養(yǎng)48 h，測(cè)定酶活力，確定最佳培養(yǎng)溫度。

1.3.3.2 培養(yǎng)基初始pH值的優(yōu)化

將培養(yǎng)基的初始pH值分別調(diào)至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0這6 個(gè)梯度，培養(yǎng)48 h，測(cè)定酶活力，從而確定Pseudomonas sp. W7產(chǎn)酶培養(yǎng)基的初始pH值。

1.3.3.3 接種量的優(yōu)化

將Pseudomonas sp. W7分別按0.5%、1%、2%、3%、4%、5%的接種量，接種到優(yōu)化后的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h，測(cè)定酶活力，從而確定最佳接種量。

1.3.3.4 裝液量的優(yōu)化

采用250 mL的三角瓶，固定轉(zhuǎn)速，通過(guò)改變裝液量來(lái)確定最佳溶解氧。試驗(yàn)設(shè)置裝液量分別為12%、20%、28%、40%，搖床轉(zhuǎn)速為100 r/min進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)48 h，測(cè)定酶活力，從而確定最佳裝液量。

1.3.3.5 搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)化

將接種后的培養(yǎng)基分別在80、100、120、140、160 r/min培養(yǎng)48 h，測(cè)定酶活力，確定最佳搖床轉(zhuǎn)速。

1.3.3.6 Pseudomonas sp. W7產(chǎn)酶的培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選擇培養(yǎng)基的初始pH值、培養(yǎng)溫度、接種量和裝液量4 個(gè)因素，進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定最佳培養(yǎng)條件。根據(jù)在最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基基礎(chǔ)上優(yōu)化的最佳培養(yǎng)條件，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

將Pseudomonas sp. W7在最佳培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，然后每隔2 h取樣，在418 nm波長(zhǎng)處測(cè)定菌體的OD值，并測(cè)定培養(yǎng)不同培養(yǎng)時(shí)間的酶活力，從而確定最佳產(chǎn)酶時(shí)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果與分析

2.1.1 Plackett-Burman試驗(yàn)及其結(jié)果分析

Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果如表2所示。分別計(jì)算各因素效應(yīng)，并進(jìn)行重要性評(píng)價(jià)。利用SAS軟件對(duì)Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)的結(jié)果進(jìn)行分析，得到回歸模型方差分析（表3）和各因素的主效應(yīng)（表4）。從中可以發(fā)現(xiàn)可信度大于95%的幾個(gè)因素均為培養(yǎng)基組分。它們對(duì)產(chǎn)酶影響順序?yàn)椋浩咸烟琴|(zhì)量濃度＞蛋白胨質(zhì)量濃度＞MgSO4質(zhì)量濃度。本試驗(yàn)所得的擬合回歸方程達(dá)到顯著性（模型的P=0.035 15＜0.05），R2=99.98%，表明本試驗(yàn)99.98%的數(shù)據(jù)變異可以用此回歸方程來(lái)解釋。所得回歸方程為：Y=163.050 0+5.4000A+3.316 7B+ 0.683 3C+0.350 0D+1.183 3E+1.183 3F+ 1.033 3G－3.366 7H－1.966 7I+2.616 7J。因此，對(duì)葡萄糖、蛋白胨和MgSO4質(zhì)量濃度3 個(gè)培養(yǎng)基組分進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化組合。

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值Table 2 Plackett-Burman design with experimental and predicted values of protease activity

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for regression model from Plackett-Burman design

表4 各因素的主效應(yīng)Table 4 Major effect of each factor

2.1.2 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

從各因素的主效應(yīng)表中可以看出在影響酶活力的各主要因素中，葡萄糖、蛋白胨和MgSO4質(zhì)量濃度都呈顯著正效應(yīng)。根據(jù)這3 個(gè)因素效應(yīng)大小的比例設(shè)定它們的變化方向和步長(zhǎng)，其他各因素分別取各自的水平進(jìn)行試驗(yàn)。

表5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 5 Steepest ascent design with experimental values of protease activity

由表5可知，隨著葡萄糖、蛋白胨和MgSO4的質(zhì)量濃度3 個(gè)主要影響因素的不同變化，酶活力的變化趨勢(shì)是先升后降，其中第3組培養(yǎng)基對(duì)應(yīng)的酶活力達(dá)到了最大值，達(dá)到176.5 U/mL，相應(yīng)變量接近最大響應(yīng)區(qū)域，所以選取第3組條件即葡萄糖4.0 g/L、蛋白胨7.0 g/L和MgSO40.14 g/L為中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面的分析。

2.1.3 響應(yīng)面分析結(jié)果

通過(guò)規(guī)范崗位大練兵工作，能夠從根本上規(guī)范隊(duì)員訓(xùn)練行為，消防訓(xùn)練安全隱患，更為隊(duì)員實(shí)戰(zhàn)滅火提供扎實(shí)的業(yè)務(wù)技能基礎(chǔ)，對(duì)保障隊(duì)員滅火安全、提升隊(duì)員救援能力起到了積極的推進(jìn)作用。下一步，治安保衛(wèi)處將結(jié)合公司應(yīng)急救援隊(duì)伍建設(shè)要求，完善崗位標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)流程大練兵內(nèi)容，為提升集團(tuán)公司應(yīng)急救援能力不斷前行。

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)的結(jié)果，設(shè)計(jì)Box-Behnken試驗(yàn)的因素與水平，設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Box-Behnken design with experimental and predicted values of protease activity

通過(guò)SAS的響應(yīng)面回歸過(guò)程進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立二次響應(yīng)面回歸模型，并進(jìn)而尋求最優(yōu)響應(yīng)因子水平。回歸方程中回歸系數(shù)的估算值見(jiàn)表7，得到擬合二次回歸方程：Y=－1 955.600 0+314.283 3A+286.608 3B+ 6 624.792 0C－36.266 7A2+0.900 0AB－112.500 0AC－20.366 7B2－30.000 0BC－20 979.170 0C2。

表7 回歸方程中回歸系數(shù)的估計(jì)Table 7 Estimated coeffi cients of regression equation from Box-Behnken design

表8 模型方程方差分析Table 8 Analysis of variance of model equation from Box-Behnken design

表7、8的數(shù)據(jù)分析表明二次響應(yīng)面回歸模型顯著（決定系數(shù)R2=0.974 2），模型擬合程度很好，說(shuō)明這3 個(gè)因素及其二次項(xiàng)能解釋酶活力變化的97.42%；模型回歸P=0.001 9；擬合不足P=0.620 4，說(shuō)明模型失擬不顯著，方程回歸顯著，所以該模型可以用于產(chǎn)酶培養(yǎng)基優(yōu)化的理論預(yù)測(cè)?；貧w方程中線性項(xiàng)和二次項(xiàng)也是顯著的（P值分別為0.001 5和0.799 0），交叉項(xiàng)不顯著，說(shuō)明響應(yīng)面分析的3 個(gè)因素之間的交互效應(yīng)較小。任意兩個(gè)因素與酶活力之間的關(guān)系可通過(guò)三維與二維圖形立體直觀地表現(xiàn)出來(lái)（圖1～3）。

在獲得回歸非線性模型和響應(yīng)面之后，對(duì)已回歸的非線性模型方程求一階偏導(dǎo)，并令其等于零得到三元一次方程組，可以得到曲面的最大點(diǎn)，求解此方程組得到最大產(chǎn)酶水平的最佳培養(yǎng)基組分質(zhì)量濃度，即葡萄糖4.25 g/L、蛋白胨7.00 g/L、MgSO40.14 g/L，酶活力預(yù)測(cè)值為180.2 U/mL，也即產(chǎn)酶水平最高時(shí)培養(yǎng)基最優(yōu)組成：葡萄糖4.25 g/L、蛋白胨7.00 g/L、干酪素4.00 g/L、K2HPO45.00 g/L、KH2PO41.00 g/L、CaCl20.26 g/L、MgSO40.14 g/L。

以該法選出的最適培養(yǎng)基組分質(zhì)量濃度進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵產(chǎn)酶水平達(dá)到183.9 U/mL，實(shí)驗(yàn)值與模型計(jì)算值相差2.05%，可見(jiàn)該模型可以較好地預(yù)測(cè)實(shí)際發(fā)酵情況。證明了響應(yīng)面分析法優(yōu)化Pseudomonas sp. W7產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基是可行有效的。經(jīng)優(yōu)化后Pseudomonas sp. W7產(chǎn)低溫蛋白酶的能力由151.8 U/mL提高到183.9 U/mL，提高了21%。

圖1 培養(yǎng)基中葡萄糖和蛋白胨質(zhì)量濃度對(duì)蛋白酶活力影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.1 Response surface and its corresponding contour plots for the effects of glucose and peptone concentration on the production of the protease

圖2 培養(yǎng)基中葡萄糖和MgSO4質(zhì)量濃度對(duì)蛋白酶活力影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.2 Response surface and its corresponding contour plots for the effects of glucose and MgSO4concentration on the production of the protease

圖3 培養(yǎng)基中MgSO4和蛋白胨質(zhì)量濃度對(duì)蛋白酶活力影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.3 Response surface and its corresponding contour plots for the effects of MgSO4and peptone concentration on the production of the protease

2.2 產(chǎn)酶條件優(yōu)化結(jié)果與分析

2.2.1 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

圖4 培養(yǎng)溫度對(duì)Pseudomonas sp. W7產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of culture temperature on the production of the protease by Pseudomonas sp. W7

如圖4所示，從10 ℃開(kāi)始隨著培養(yǎng)溫度的升高酶活力逐漸增大，在20 ℃時(shí)酶活力達(dá)到最大值，而后隨著培養(yǎng)溫度的升高，酶活力逐漸下降，到30 ℃時(shí)，酶活力僅為最大酶活力的15%。可見(jiàn)培養(yǎng)溫度對(duì)Pseudomonas sp. W7的分泌蛋白酶的影響比較顯著。低溫能夠誘導(dǎo)能夠提高酶的表達(dá)量，而且溫度有時(shí)也影響耐冷菌分泌低溫蛋白酶的種類[25]。因此，Pseudomonas sp. W7產(chǎn)酶的最佳培養(yǎng)溫度為20 ℃。

2.2.2 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)Pseudomonas sp. W7產(chǎn)酶的影響

試驗(yàn)分別控制發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值在5～10之間進(jìn)行培養(yǎng)，在不同pH值條件下所測(cè)得的酶活力表明：pH值對(duì)微生物的生長(zhǎng)代謝有重要影響，當(dāng)處于最適pH值時(shí)，菌體的產(chǎn)酶速率最快，故其酶活力也最大。由圖5可知，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值在7.0時(shí)，酶活力可達(dá)最大，所以Pseudomonas sp. W7產(chǎn)酶的最佳pH值為7.0。

圖5 培養(yǎng)基的初始pHH 值對(duì)Pseudomonas sp. W7產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of initial medium pH on the production of the protease by Pseudomonas sp. W7

2.2.3 接種量對(duì)Pseudomonas sp. W7產(chǎn)酶的影響

分別以0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%的不同接種量作對(duì)比進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖6，當(dāng)接種量為2%時(shí)，酶活力可達(dá)到最大值，所以最適接種量為2%。

圖6 接種量對(duì)Pseudomonas sp. W7產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of inoculum amount on the production of the protease by Pseudomonas sp. W7

2.2.4 裝液量對(duì)Pseudomonas sp. W7產(chǎn)酶的影響

試驗(yàn)設(shè)計(jì)裝液量分別為12%、20%、28%、40%，搖床轉(zhuǎn)速為100 r/min進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果如圖7所示，當(dāng)250 mL三角瓶的裝液量為50 mL時(shí)，測(cè)得的酶活力最高，所以最適裝液量為20%。

圖7 裝液量對(duì)Pseudomonas sp. W7產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of medium loading volume on the production of the protease by Pseudomonas sp. W7

2.2.5 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)Pseudomonas sp. W7產(chǎn)酶的影響

圖8 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)Pseudomonas sp. W7產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effect of rotation speed on the production of the protease by Pseudomonas sp. W7

采用250mL的三角瓶，在其他培養(yǎng)條件一定的情況下，改變搖床轉(zhuǎn)速來(lái)檢測(cè)搖床轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖8所示，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為100 r/min時(shí)產(chǎn)酶達(dá)到最大值，隨著搖床轉(zhuǎn)速的增大，產(chǎn)酶沒(méi)有明顯的變化，搖床轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酶的影響不大。因此，確定最佳的搖床轉(zhuǎn)速為100r/min。

2.2.6 產(chǎn)酶條件正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

通過(guò)對(duì)Pseudomonas sp. W7產(chǎn)酶培養(yǎng)條件的單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)酶活力影響較大的4 個(gè)因素，即培養(yǎng)基的初始pH值、培養(yǎng)溫度、接種量和裝液量進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)。

表9 產(chǎn)酶條件的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析Table 9 Orthogonal array design with experimental values of protease activity

表10 產(chǎn)酶條件的正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 10 Analysis of variance of the experimental results of orthogonal array design

由表10可知，從方差分析結(jié)果（F比）可以看出，培養(yǎng)條件對(duì)產(chǎn)酶的影響的顯著性次序?yàn)椋号囵B(yǎng)基的初始pH值＞培養(yǎng)溫度＞接種量＞裝液量。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果（表9）中k值表明：Pseudomonas sp. W7產(chǎn)低溫蛋白酶最佳的條件為培養(yǎng)基的初始pH7.0、培養(yǎng)溫度20℃、接種量3%、裝液量20%。根據(jù)上述優(yōu)化的最佳培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，實(shí)際測(cè)得的酶活力為193.2 U/mL。

2.2.7 Pseudomonas sp. W7的生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酶曲線

圖9 Pseudomonasmonas sp. W7的生長(zhǎng)曲線與產(chǎn)酶曲線Fig.9 Growth and protease production curves of Pseudomonas sp. W7

在最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)條件下測(cè)定并繪制了Pseudomonas sp. W7的生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酶曲線。由圖9可知，Pseudomonas sp. W7在6 h左右進(jìn)入對(duì)數(shù)期，22 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。低溫蛋白酶的產(chǎn)生與菌體生長(zhǎng)呈現(xiàn)正相關(guān)。菌體生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)期后即分泌低溫蛋白酶，酶活力不斷上升，在48 h時(shí)達(dá)到最高，后略有波動(dòng)。

3 結(jié) 論

采用響應(yīng)面優(yōu)化法快速篩選影響Pseudomonas sp. W7菌株產(chǎn)低溫蛋白酶培養(yǎng)基中的顯著因素，并通過(guò)建立多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型，采用統(tǒng)計(jì)分析對(duì)模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)來(lái)優(yōu)化產(chǎn)酶培養(yǎng)基的最佳組成。優(yōu)化得到的最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基為：葡萄糖4.25 g/L、蛋白胨7.00 g/L、干酪素4.00 g/L、K2HPO45.00 g/L、KH2PO41.00 g/L、CaCl20.26 g/L、MgSO40.14 g/L。優(yōu)化后，Pseudomonas sp. W7的產(chǎn)酶能力達(dá)到183.9 U/mL，比優(yōu)化前提高了21%。在單因素的基礎(chǔ)上利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)產(chǎn)酶的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確定產(chǎn)酶的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為20 ℃、培養(yǎng)基的初始pH值為7.0、接種量為3%、裝液量為20%、搖床轉(zhuǎn)速為100 r/min。在最佳條件時(shí)測(cè)得的酶活力為193.2 U/mL。通過(guò)生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酶曲線的測(cè)定，確定產(chǎn)酶的培養(yǎng)時(shí)間為48 h。

對(duì)低溫酶的研究無(wú)論在基礎(chǔ)資源發(fā)掘方面，還是在產(chǎn)業(yè)應(yīng)用方面都具有重要意義。本研究對(duì)Pseudomonas sp. W7產(chǎn)低溫蛋白酶培養(yǎng)基及產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，為Pseudomonas sp. W7進(jìn)一步的工業(yè)化生產(chǎn)、耐冷菌以及低溫蛋白酶的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

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Optimization of Medium Components and Culture Conditions for Cold-Adapted Protease Produced by Pseudomonas sp. W7

KANG Chuanhong1, TIAN Yaxin2, LI Xiuliang2, DONG Yijie2, YUAN Jihong1, WANG Yunlai2, HAN Xiaoyun2,*
(1. School of Chemistry and Material Sciences, Heilongjiang University, Harbin 150080, China; 2. School of Life Sciences, Heilongjiang University, Harbin 150080, China)

Cold-adapted proteases have great superiority in the food, cosmetic, pharmaceutical and detergent industries due to high catalytic activity at low temperature and thermal instability. In the present study, the Plackett-Burman design was used to identify glucose, peptone and MgSO4as the most signifi cant medium components affecting the production of cold-adapted protease by Pseudomonas sp. W7. Then the steepest ascent experiment was used to approach the optimal region of the three medium components. Box-Behnken design and response surface analysis were used to determine the best culture medium containing 4.25 g/L glucose, 7.00 g/L peptone, 4.00 g/L casein, 5.00 g/L K2HPO4, 1.00 g/L KH2PO4, 0.26 g/L CaCl2and 0.14 g/L MgSO4. After the optimization, the yield of the protease was increased by 21% to 183.9 U/mL. In addition, the optimal culture conditions for producing cold-adapted protease using the optimized medium were determined using combination of single factor experiments and orthogonal array design experiments as culture temperature of 20 ℃, initial medium pH of 7.0, inoculum amount of 3%, medium loading volume of 20% and rotation speed of 100 r/min. Under these conditions, the enzyme activity w as 193.2 U/mL. Based on the growth curve and enzyme production curve, the optimal culture period was determined to be 48 h.

cold-adapted protease; Pseudomonas sp. W7; optimization of fermentation conditions; response surface analysis

Q814.9

A

1002-6630（2015）19-0163-07

10.7506/spkx1002-6630-201519029

2014-10-29

黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（C201035）

康傳紅（1966-），女，教授，博士，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)。E-mail：kangchh@163.com

*通信作者：韓曉云（1970-），女，副教授，博士，研究方向?yàn)樯锕こ?。E-mail：zbjnefu@126.com