川皮苷體外抗氧化活性及對腫瘤細胞生長抑制作用

張 玉，李洪軍，竇華亭，賀稚非

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶 400715；3.西南大學柑桔研究所，重慶 400712）

川皮苷體外抗氧化活性及對腫瘤細胞生長抑制作用

張 玉1,2，李洪軍1,*，竇華亭3，賀稚非1

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶 400715；3.西南大學柑桔研究所，重慶 400712）

目的：研究川皮苷的抗氧化活性及對腫瘤細胞生長抑制作用。方法：在體外測定川皮苷對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羥自由基（·OH）和超氧陰離子自由基的清除能力；通過四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法篩選對川皮苷作用敏感的腫瘤細胞株，并用倒置顯微鏡和透射電鏡觀察敏感細胞株在川皮苷作用之后細胞結構的變化。結果：川皮苷在體外對DPPH自由基、·OH和O2－·都具有清除能力，其中對·OH的清除能力突出。同時，人胰腺癌細胞株PANC-1對川皮苷作用敏感，即川皮苷可抑制PANC-1細胞的生長；透射電鏡觀察發現川皮苷可使PANC-1細胞的細胞核膜破裂，胞質溶出，形成凋亡小體。結論：川皮苷具有顯著的體外抗氧化活性，并且可以抑制PANC-1細胞的增殖，在功能食品等領域具有良好的應用前景。

川皮苷；抗氧化；細胞增殖

自由基是人體進行生命活動時所產生的一種活性分子，可以調節細胞間的信號傳導和細胞生長[1-3]。但自由基的過度氧化會引起蛋白質、核酸等生命物質的損壞，對機體造成損傷，細胞癌變的過程中就有自由基的參與[4-10]。因此，清除機體內過多的自由基對癌癥的發生和發展有著至關重要的作用[11-15]。川皮苷（nobiletin，NOB）是柑橘屬植物中的特征黃酮，是一種多甲氧基黃酮類化合物[16-23]。有研究表明，多甲氧基黃酮中甲氧基的數量和取代基位置決定了其抗氧化能力的強弱，其中NOB是具有強抗氧化活性的多甲氧基黃酮[11]。

本實驗以NOB為材料，比較不同濃度的NOB對不同種類自由基的清除能力，并采用VC作為對照來考察NOB抗氧化能力的強弱。同時通過研究NOB對人乳腺癌細胞株MCF-7、人肺癌細胞株A549、人胰腺癌細胞株PANC-1生長活力的影響，篩選對NOB敏感的細胞株。通過NOB與敏感細胞株的時-效、量-效關系確定最適培養時間和最適NOB添加量，并將NOB作用于敏感細胞株，對細胞形態、抑制效果等指標進行考察，探討NOB對敏感細胞株的生長抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

川皮苷（NOB）從甜橙皮渣中分離得到（甜橙皮渣由重慶市三峽果業有限公司提供），精制后經高效液相色譜檢測純度為98%；MCF-7、A549、PANC-1細胞株上海中科院細胞庫。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、VC、四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT） 美國Sigma公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、RPMI-1640培養基、MEM培養基 美國Gibco公司；胎牛血清 天津TBD公司；雙抗（青霉素、鏈霉素）、胰酶 北京賽馳生物公司；其他常規試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

DFM-20C熒光倒置顯微鏡 日本Olympus公司；TECNAI-10透射電子顯微鏡 荷蘭Philips公司；DG3022酶標儀 美國Bio-Tek公司；TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；UV-7504紫外分光光度計 上海欣茂有限公司。

1.3 方法

1.3.1 川皮苷體外抗氧化能力的測定

1.3.1.1 DPPH自由基清除能力的測定

將2 mL濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mmol/L的NOB溶液（以VC溶液作為陽性對照）與2 mL 2×10?4mol/L DPPH溶液混合后搖勻，避光放置30 min，測定吸光度A1；對照組以無水乙醇替代樣品，其他操作相同，測定吸光度A0；空白組為2 mL樣品與2 mL無水乙醇（替代DPPH溶液）混合，其他操作相同，測定吸光度A2。按照公式（1）計算不同濃度的NOB溶液和VC溶液對DPPH自由基的清除率。

1.3.1.2 羥自由基（·OH）清除能力的測定

取0.75 mL 5 mmol/L的鄰二氮菲無水乙醇溶液，加入2 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.75 mol/L，pH 7.4），混合均勻后，加入0.5 mL 7.5 mmol/L FeSO4溶液和2.5 mL濃度分別為0.125、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 μmol/L NOB溶液（以VC溶液作為陽性對照），混合均勻，再加入0.5 mL體積分數1%的H2O2，于37 ℃水浴60 min，在536 nm波長處測定吸光度AS。對照組以2.5 mL蒸餾水代替樣品，其他操作相同，測定吸光度AP。空白組以2.5 mL蒸餾水代替樣品，0.5 mL蒸餾水代替0.5 mL H2O2，其他操作相同，測定吸光度AB。按照公式（2）計算不同濃度的NOB溶液和VC溶液對·OH的清除率。

1.3.1.3 超氧陰離子自由基（O2－·）清除能力的測定

在試管中加入5 mL Tris-HCl（0.05 mol/L，pH 8.2）緩沖溶液，再緩慢加入1 mL濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mmol/L NOB溶液（以VC溶液作為陽性對照），混合均勻后置于25 ℃條件下放置20 min。然后加入0.2 mL 2 mmol/L鄰苯三酚溶液，混合均勻，反應4 min后，置于325 nm波長處測定其吸光度A1。空白組以1 mL蒸餾水代替樣品溶液，其他操作相同，測定吸光度A0。按照公式（3）計算不同濃度的NOB溶液和VC溶液對O2－·的清除率。

1.3.2 細胞培養

MCF-7細胞：含10%（體積分數，下同）胎牛血清的MEM培養基，添加1%雙抗；A549細胞：含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，添加1%雙抗；PANC-1細胞：含10%胎牛血清的RPMI-1640培基，添加1%雙抗。3 種細胞株同時置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱中培養，在倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁情況，確定稀釋倍數，用PBS反復清洗，以0.25%胰酶消化，進行傳代培養。

1.3.3 細胞生長活力測定

細胞生長活力測定方法參照文獻[24]。取對數生長期的細胞，以103～105個/孔接種于96 孔板。置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱中培養。待細胞生長達到60%～70%，加入NOB終濃度分別0、2.5、5、10、20、40、60 μmol/L的新培養基，分別培養至24、48 h后，每孔加MTT溶液20 μL；繼續孵育4 h，每孔加二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）150 μL，將96 孔板在脫色搖床上振蕩10 min，測定490 nm波長處的吸光度，按照公式（4）計算細胞活力。以NOB濃度為橫坐標，細胞活力為縱坐標作圖，篩選敏感細胞株。

式中：A0為空白孔（只加培養基）吸光度；A1為正常孔（正常細胞，不加藥物處理）吸光度；A2為加藥組吸光度。

1.3.4 透射電鏡下細胞形態觀察

取對數生長期的PANC-1細胞，將細胞密度調整為1×105個/mL，接種到6 孔板，2 mL/孔。待細胞生長達到60%～70%，加入NOB終濃度為100 μmol/L的新培養基，繼續培養48 h。然后用胰酶消化并收集細胞，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，加PBS混勻，1 000 r/min離心10 min，棄去PBS，加1 mL質量分數2.5%的丙二醛，4 ℃條件下保存，待檢。

1.4 數據統計分析

實驗數據采用SPSS 16.0分析，實驗結果用 ±s表示。

2 結果與分析

2.1 NOB的DPPH自由基清除能力

圖1 NOB與VC對DPPH自由基的清除能力（n=3）Fig.1 Scavenging effects of NOB and VC on DPPH free radicals (n = 3)

如圖1所示，NOB和VC都具有清除DPPH自由基的能力。在濃度≤1.60 mmol/L范圍內，隨著濃度的增加，NOB和VC兩者對DPPH的清除能力都逐漸增強。當濃度高于0.8 mmol/L時，NOB對DPPH自由基的清除能力無顯著性變化（P＞0.05）；同時VC對DPPH自由基的清除能力增強也不顯著（P＞0.05）。總體看來，NOB對DPPH自由基清除能力強于VC。

2.2 NOB的·OH清除能力

圖2 NOB和VC對·OH的清除能力（n=3）Fig.2 Scavenging effects of NOB and VC on hydroxyl free radicals (n = 3)

如圖2所示，隨著NOB濃度的增加，NOB對·OH的清除能力顯著增強，當濃度低于0.750 μmol/L時，NOB 對·OH的清除能力呈線性增長趨勢；而當NOB濃度高于1.250 μmol/L后，其對·OH的清除能力接近100%。而VC在本實驗所選濃度范圍內對·OH無清除能力。由此可見，在實驗所選濃度范圍內，NOB對·OH的清除效果更好。

圖3 NOB和VCC 對OO－2·的清除能力（n==33）Fig.3 Scavenging effects of NOB and VC on superoxide anion radicals (n = 3)

如圖3所示，在0.05～1.60 mmol/L濃度范圍內，隨著NOB濃度的增加，其對O2－·的清除能力逐漸增強，尤其是在0.05～0.80 mmol/L濃度范圍內，其對O2－·的清除能力呈線性增長趨勢。而在0.05～0.20 mmol/L濃度范圍內，VC 對O2－·的清除能力為0；當濃度在0.80～1.60 mmol/L范圍內時，VC對O2－·的清除能力略高于NOB。

2.4 對川皮苷敏感的腫瘤細胞篩選結果

圖4 NOB對不同腫瘤細胞株的影響（n=6）Fig.4 Inhibitory effect of NOB on the growth of different tumor cells (n=6)

如圖4所示，不同濃度的NOB作用于PANC-1、A549、MCF-7這3 種腫瘤細胞株后，會對細胞活力產生不同的影響。NOB作用PANC-1細胞24 h后，細胞活力下降至（71.22±6.80）%；繼續培養至48 h時，PANC-1細胞活力變化較24 h時無顯著變化（P＞0.05）。由此可見，NOB對PANC-1細胞的增殖有一定抑制作用。NOB作用于A549細胞24 h后，細胞活力下降至（82.35±7.50）%，繼續培養至48 h時，在所選濃度范圍內，A549細胞活力仍維持在90%左右，說明A549細胞對NOB不敏感。NOB作用于MCF-7細胞24 h后，細胞活力已經下降至（67.04±4.80）%，繼續培養至48 h時，MCF-7細胞活力繼續下降至（57.17±1.40）%。由此可見，MCF-7細胞對NOB非常敏感，細胞活力在低濃度條件下下降顯著（P＜0.05），此結果與文獻[8]報道一致。由于NOB對MCF-7細胞株的作用已有報道，且與本實驗結果一致，故本實驗不再對MCF-7做進一步的研究。

2.4 PANC-1細胞的形態變化

圖5 NOB濃度和處理時間對PANC-1細胞形態的影響（20×）Fig.5 Morphology of PANC-1 cells treated with NOB (20 ×)

如圖5所示，在倒置顯微鏡下觀察經NOB處理的PANC-1細胞，對照組細胞呈近圓形，細胞間結構緊密，細胞生長旺盛（圖5a）；而經NOB處理后，PANC-1細胞形狀發生變化，呈現無規則狀態，輪廓感增強，反差增大，細胞浮起，細胞間距離增大，細胞數量有所減少，并且隨著NOB濃度的增加，其變化程度加劇（圖5b～5d）。并且在NOB濃度相同（100 μmol/L）的條件下，隨著培養時間的延長，PANC-1細胞形態變化明顯，細胞拉長，細胞質分布不均勻，細胞間聯系松散，大量細胞浮起，細胞數量也明顯減少（圖5e、5c、5f）。

圖6 掃描電鏡下NOB處理前后PANC-1細胞的形態Fig.6 Morphology of PANC-1 cells treated with NOB

如圖6所示，通過透射電鏡觀察發現，對照組PANC-1細胞表面微絨毛豐富，使相鄰細胞被微絨毛所連接；細胞質均勻，向四周伸展；細胞器區分明顯，核膜、核仁清晰可見。而100 μmol/L NOB組PANC-1細胞表面微絨毛稀少；細胞間分離，輪廓感增強；細胞質減少，細胞器萎縮；核膜破裂，胞質溶出，逐漸形成凋亡小體。

3 討 論

本研究將NOB和VC對不同自由基的清除能力作比較，以評價NOB對自由基清除作用的有無與強弱。實驗結果表明，NOB對DPPH自由基、·OH和O2－·都有較強的清除能力，尤其是在實驗所選濃度范圍內，對·OH的清除能力比VC高數10 倍。同時，NOB對PANC-1和MCF-7兩種細胞敏感，由于NOB對MCF-7細胞株的作用已另有文獻[8]報道，且與本實驗結果一致，故本實驗不再對MCF-7做進一步的研究。因此本研究以PANC-1細胞作為研究對象，探討NOB對其形態學的影響。結果顯示，經不同濃度NOB處理后的PANC-1細胞均出現不同程度的變形、細胞分離、數量減少。通過透射電鏡觀察發現，用100 μmol/L的NOB處理48 h，PANC-1細胞形態變化明顯，細胞微絨毛明顯減少、細胞質分布不均勻，細胞呈現凋亡趨勢。

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Antioxidant Activity in vitro of Nobiletin and Its Inhibitory Effect on the Proliferation of Tumor Cells

ZHANG Yu1,2, LI Hongjun1,*, DOU Huating3, HE Zhifei1
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. Chongqing Engineering Research Center of Regional Food, Chongqing 400715, China; 3. Citrus Research Institute, Southwest University, Chongqing 400712, China)

Objective: To investigate the antioxidant activity of nobiletin and its inhibitory capacity on the proliferation of cancer cells in vitro. Methods: The scavenging activities of nobiletin on DPPH, hydroxyl and superoxide anion radicals were detected. MTT assay was utilized to evaluate the effect of nobiletin on the growth of different tumor cells. The changes in organelles and cell morphology were observed through inverted microscope and transmission electron microscope. Results: Nobiletin had a strong ability to scavenge DPPH, hydroxyl and superoxide anion radicals, especially to remove hydroxyl radical. Nobiletin had a signifi cant inhibitory effect on the growth of PANC-1 cells. The viability and proliferation of PANC-1 cells were decreased in culture medium with nobiletin. As observed under inverted microscope and transmission electron microscope, nobiletin could result in disruption of the nuclear membrane, release of cytoplasmic contents and generation of apoptotic bodies. Conclusion: Nobiletin has excellent capability to scavenge free radicals and inhibit the proliferation of human PANC-1 cells.

nobiletin; antioxidant activity; cell prol iferation

R151

A

1002-6630（2015）19-0233-05

10.7506/spkx1002-6630-201519042

2014-11-12

中央高校基本科研業務費專項資金項目（XDJK2014C071）；西南大學教育教學改革研究項目（2013JY062）；

重慶市北碚區集成示范計劃項目（2014-68）；重慶市特色食品工程技術研究中心能力提升項目（cstc2014pt-gc8001）

張玉（1984-），女，實驗師，博士，研究方向為食品科學。E-mail：zhangyu_512@sina.cn

*通信作者：李洪軍（1961-），男，教授，博士，研究方向為農產加工及貯藏工程。E-mail：983362225@qq.com