響應面優化L－賴氨酸培養基

滕國生 劉 勇 武麗達 范春艷 王金枝 關 兵 史淑輝 佟 毅

（1.吉林中糧生化有限公司，吉林 長春 130012；2.玉米深加工國家工程研究中心，吉林 長春 130012；3.長春工業大學化學與生命科學學院，吉林 長春 130012）

賴氨酸是合成人和動物組織蛋白質的必需物質，是激素、體內酶、抗體等重要功能性物質的主要成分，人體和動物自身不能合成賴氨酸，必須從食物中攝取，而植物中含有的賴氨酸很少，被稱為植物中第一限制性氨基酸［1，2］。國內外市場對賴氨酸的需求都非常大，主要用于飼料生產，約占90%左右，食品添加劑和強化劑占5%左右，還有5%用于醫藥中間體方面［3］。由25～30個賴氨酸殘基聚合而成的ε－多聚賴氨酸是一種良好的食品防腐劑［4］。賴氨酸的市場需求迅速增長拉動了L－賴氨酸的生產，未來幾年，中國食品工業賴氨酸的市場需求平均年增長將在10%左右［5］。隨著用賴氨酸生產各種藥物的需求量的增加，中國賴氨酸需求量目前估計在8萬t/年左右［6］。賴氨酸的生產方法主要有提取法、化學合成法、酶法、微生物發酵法［6］。微生物發酵產生的賴氨酸均為L－型，而生物所能利用的賴氨酸也為L－型。因此，微生物發酵法是目前工業生產L－賴氨酸最主要的方法［7］。

玉米漿為生產玉米淀粉的副產物，含有大量的糖類、多肽、生長素、可溶性蛋白質、游離氨基酸等其他有機物，是微生物發酵氨基酸的良好氮源［8－10］。玉米漿中很多成分是發酵生產氨基酸的前體成分，在氨基酸發酵中提供氮源和生長因子，玉米中的生物素、限制性氨基酸對多種氨基酸發酵的影響都很大［11］。玉米漿價格低廉，來源豐富，利用玉米漿發酵氨基酸有利于提高玉米漿的生物價值，降低工業生產氨基酸的成本。

響應面法是工藝優化常用的試驗設計方法［12－14］。Plackett－Burman確定出主次因素。最陡爬坡法能夠快速尋找各變量變化最優區域。這3種試驗設計方法常用于微生物培養基的優化［15－18］。本試驗擬運用 Design Experts 7.0分析軟件，將Plackett－Burma（PB）方法和響應面法應用于L－賴氨酸發酵培養基成分的優化和發酵工藝關鍵參數的篩選，以期進一步提高L－賴氨酸產量，降低工業生產氨基酸的成本。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

L－賴氨酸棒桿菌株（代號：ATCC14067）：由吉林大學生命科學學院提供。

1.1.2 試驗試劑

KH2PO4、MgSO4·7H2O、蘇氨酸、CaCO3、NH4Cl、NaCl：分析純，北京化工廠。

1.1.3 試驗儀器

紫外分光光度計：UVMINI－1240型，日本島津株式會社；

恒溫搖床，SPX－150－Z型，中國上海躍進醫療器械廠。

1.1.4 培養基

種子培養基：葡萄糖20g/L，玉米漿20g/L，KH2PO40.01%，MgSO4·7H2O 0.01%，CaCO34%，pH 7.0～7.2，0.75kg/cm2滅菌20min。

發酵培養基：葡萄糖40g/L，玉米漿40g/L，KH2PO40.02%，NH4Cl 6%，NaCl 1.8%，蘇氨 酸 0.06%，CaCO36%，MgSO4·7H2O 0.02%，pH 7.0～7.2，0.75kg/cm2滅菌20min。

1.2 培養方法

菌株經斜面活化后，取一環接入到含有40mL種子培養基的250mL三角瓶中，于30℃中以200r/min震蕩培養24h。取5mL培養后溶液接種到含有100mL發酵培養基的250mL三角瓶中，于30℃以200r/min震蕩培養48h。將發酵液于8 000r/min下離心10min，取上清液測定其中L－賴氨酸含量。每組相同發酵培養基平行試驗3次，含量取平均值。

1.3 L－賴氨酸含量測定

采用茚三酮比色法［19］測定L－賴氨酸濃度，配制濃度為500μg/L的L－賴氨酸標準溶液，分別取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mL于干凈的具塞比色管中，加水至1.0mL，再加入1.0mL茚三酮試劑，搖勻后塞緊管塞，沸水浴5min后冷卻至室溫，每管再加入50%乙醇8.0mL，于530nm處測定OD值。以L－賴氨酸含量為橫坐標，OD值為縱坐標做標準曲線。得到線性回歸方程為Y＝1.866x＋0.018（R2＝0.999 0）。以樣品代替標準溶液，通過方程計算其L－賴氨酸含量。

1.4 試驗設計

1.4.1 Plackett－Burman設計 本試驗選取8種培養基成分，選用N＝8的Plackett－Burman設計。根據預試驗，設定每個因素的高水平約為低水平的2倍，試驗12次，響應值為L－賴氨酸含量。PB設計因素水平見表1。

表1 Plackett－Burman設計因素水平表Table 1 Factors and levels of Plackett－Burman design

1.4.2 最陡爬坡試驗 根據PB設計的結果，由各因素效應值的大小確定變化的步長。正效應取高水平，負效應取低水平。按一定的梯度增加或者減少各因素的水平值，檢測發酵液中L－賴氨酸含量的變化，含量最高組的水平值即為響應面分析的中心組。

1.4.3 響應面分析方法 根據PB設計篩選出的3個顯著因素作為試驗因素，根據最陡爬坡試驗篩選出的濃度作為中心點，采用響應面中的Box－Behnken設計方法。

1.4.4 數據分析 采用Design Expert 7.0軟件對數據進行回歸分析，得最優組合。

2 結果與分析

2.1 Plackett－Burman設計結果與分析

采用Design Expert 7.0軟件對表2進行分析，得到各影響因子的偏回歸系數及其顯著性結果，見表3。在8個因素中，C、E、H因素即 NaCl、MgSO4·7H2O、玉米漿對L－賴氨酸的得率影響顯著（P＜0.05），故將 NaCl、MgSO4·7H2O、玉米漿確定為主要影響因素，且NaCl、MgSO4·7H2O為正效應，玉米漿為負效應。故在下一步試驗中，應該在NaCl、MgSO4·7H2O的高水平基礎上增加其含量，在玉米漿的低水平基礎上減少其含量。對于影響不顯著的因素，正效應因素與負效應因素分別?。?水平和－1水平。

2.2 最陡爬坡試驗結果與分析

根據PB試驗結果中因素NaCl、MgSO4·7H2O、玉米漿效應的大小確定最陡爬坡試驗變化的方向和步長。由表4可知，5組試驗中，第4組的L－賴氨酸含量最高，故選擇第4組的水平為下一步響應面設計的中心點，即NaCl 2.6%、MgSO4·7H2O 0.05%、玉米漿19.5%。

2.3 響應面設計結果與分析

Box－Behnken設計因素及水平取值見表5。

通過Design Expert 7.0軟件對表6數據進行處理，得到回歸方程為：

表2 Plackett－Burman試驗設計及結果Table 2 The Plackett－Burman design and results

表3 Plackett－Burman設計各因素的偏回歸系數及其顯著性Table 3 Partial regression coefficients and significance of factors in Plackett－Burman design

表4 最陡爬坡試驗設計及結果Table 4 Steepest ascent design and results

表5 Box－Behnken設計因素水平表Table 5 Factors and levels of Box－Behnken design

對此模型進行方差分析（表7）可知：擬合度R2＝0.973 7，說明該試驗提取得率的試驗值與預測值之間有很好的擬合度；P＜0.01說明該模型極其顯著；失擬量為2.22說明失擬量相對于純誤差不顯著；信噪比為12.603＞4表明該模型有足夠的信噪比；該模型的F值為20.56，失擬項不顯著。綜上表明，該模型預測值與試驗值的差異很小可用于指導試驗。

在此模型中 A、B、AB、A2、B2均顯著，C、AC、BC、C2不顯著，同時各因素的均方值可以反映出各個因素對試驗指標的重要性。均方值越大表明其對試驗指標的影響越大。從表7的均方值可以看出影響賴氨酸得率因素的主次順序為：A＞B＞C，即NaCl＞MgSO4·7H2O＞玉米漿。

表6 Box－Behnken設計及結果Table 6 The Box－Behnken design and results

表7 回歸模型的方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

表7 回歸模型的方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

“＊”表示差異顯著，P＜0.05；“＊＊”表示差異極顯著，P＜0.01；“—”表示不顯著。

來源 平方和 自由度 均方 F值 Pr＞F 顯著性模型 640.80 9 71.20 20.56 0.002 0 17.32 5 3.46失擬項 13.32 3 4.44 2.22 0.325 2 —純誤差 3.99 2 2.00總誤差＊＊A 101.75 1 101.75 29.38 0.002 9 ＊＊B 41.72 1 41.72 12.05 0.017 8 ＊C 9.03 1 9.03 2.61 0.167 3 —AB 26.94 1 26.94 7.78 0.038 5 ＊AC 2.67 1 2.67 0.77 0.419 8 —BC 1.73 1 1.73 0.50 0.511 4 —A2 392.35 1 392.35 113.29 0.000 1 ＊＊B2 90.96 1 90.96 26.26 0.003 7 ＊＊C2 4.72 1 4.72 1.36 0.295 6 —殘差658.11 14

各因素交互作用對L－賴氨酸得率的相應曲面和等高線圖見圖1～3。由圖1～3可知，NaCl與MgSO4·7H2O的交互作用顯著。當玉米漿的含量一定時，隨著培養基中NaCl和MgSO4·7H2O含量的增加，L－賴氨酸的得率先逐漸增加后逐漸降低，在 NaCl和 MgSO4·7H2O分別為2.66%，0.04%時達到最大值，此時L－賴氨酸得率為101.32g/L。當MgSO4·7H2O含量一定時，玉米漿與NaCl的交互作用并不顯著；而當NaCl含量一定時，玉米漿與MgSO4·7H2O的交互作用也不顯著。顯示玉米漿的添加量對L－賴氨酸的得率影響不大，隨著玉米漿含量的增加，L－賴氨酸的得率均略微有所增加，但增加的幅度都不大。

經過Design Experts 7.0軟件的響應面優化設計，分析優化得到的最佳條件為 NaCl 2.72%，MgSO4·7H2O 0.05%，玉米漿21.13g/L，在此條件下，L－賴氨酸的理論得率為104.75g/L。通過對此最優模型進行3次驗證，結果分別為104.52，104.97，104.60g/L，平均值為104.70g/L，與模型的理論值基本符合，說明該模型能夠較好的預測實際發酵中L－賴氨酸的得率。

圖1 NaCl與MgSO4·7H2O交互影響L－賴氨酸得率的響應面圖和等高線圖Figure 1 Response surface plot and contour plot of effect of sodium chloride and magnesium sulfate on L－lysine yield

圖2 NaCl與玉米漿交互影響L－賴氨酸得率的響應面圖和等高線圖Figure 2 Response surface plot and contour plot of effect of sodium chloride and corn starch on L－lysine yield

圖3 MgSO4·7H2O與玉米漿交互影響L－賴氨酸得率的響應面圖和等高線圖Figure 3 Response surface plot and contour plot of effect of magnesium sulfate and corn starch on L－lysine yield

3 結論

本試驗運用Design Experts 7.0分析軟件，先通過Plackett－Burman方法和響應面法確定了影響L－賴氨酸得率的主要因素為NaCl、MgSO4·7H2O和玉米漿，再通過爬坡試驗和Box－Behnken設計方法，確定3個主要因素物質的添加量分別為2.72%，0.05%和21.13g/L，理論 L－賴氨酸得率為104.75g/L。經3次驗證實驗，平均值為104.60g/L，與理論值相符。此實際值與優化前的87.93g/L相比，提高了18.96%。因此，利用響應面分析方法優化L－賴氨酸棒桿菌株產L－賴氨酸的方法是可行的，同其它微生物發酵方法相比，此種方法降低了葡萄糖的含量，可以充分利用玉米漿所含營養物質，降低生產成本，更適宜工業生產。

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