丁苯酞對慢性低灌注大鼠認(rèn)知功能的保護(hù)作用

魏 微 黃永華 張微微

北京軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 北京 100700

丁苯酞對慢性低灌注大鼠認(rèn)知功能的保護(hù)作用

魏 微 黃永華△張微微

北京軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 北京 100700

目的 通過建立雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎動物模型探討慢性低灌注后認(rèn)知功能的變化及丁苯酞的保護(hù)作用。方法雄性Wistar大鼠48只隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血模型組、丁苯酞組。缺血組與丁苯酞組大鼠結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈。Morris水迷宮行為學(xué)實驗評估1個月后各組大鼠空間認(rèn)知功能。結(jié)果 慢性低灌注后1月大鼠認(rèn)知功能減退，丁苯酞治療組逃避潛伏期較缺血組明顯增加，顯著延長在第四象限停留時間（P＜0.05）。結(jié)論 丁苯酞對慢性低灌注大鼠認(rèn)知功能損害有保護(hù)作用。

慢性低灌注；丁苯酞；認(rèn)知功能

腦慢性低灌注是和短暫性腦缺血對應(yīng)的一個概念，腦部始終都處于一種低灌注的狀態(tài)。用腦的慢性低灌注模型來模擬輕度認(rèn)知功能損害［1］。丁苯酞是我國自行研制的一種治療腦缺血的新藥，能緩解小血管的痙攣、保護(hù)神經(jīng)元的線粒體、抑制血小板的聚集等多環(huán)節(jié)來阻斷腦缺血的病理過程。丁苯酞對腦慢性低灌注后認(rèn)知功能是否具有保護(hù)作用少見報道［2］。本研究旨在通過建立雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎動物模型探討慢性低灌注后認(rèn)知功能的變化及丁苯酞的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料（1）動物材料：成年雄性SPF級Wistar大鼠48只，體質(zhì)量250～300g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供［動物合格證編號：SCXK-（軍）2007-004］。（2）主要試劑：丁苯酞注射液（購于石藥集團(tuán)股份有限公司）。

1.2 實驗方法與步驟

1.2.1 大鼠分組及干預(yù)：雄性Wistar大鼠48只隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血模型組、丁苯酞組，每組各16只。10％水合氯醛（350mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠后仰臥位固定，沿頸正中切口切開皮膚，逐層剝離開胸骨舌骨肌、肩胛舌骨肌以及胸鎖乳突肌后暴露出頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈，小心分離頸總動脈和迷走神經(jīng)。缺血組與丁苯酞組大鼠永久結(jié)扎頸總動脈，假手術(shù)組不結(jié)扎頸總動脈，后縫合皮膚。在層流動物室飼養(yǎng)（大鼠總病死率6.25％，大鼠共死亡3只，按需補(bǔ)足）。丁苯酞組大鼠每日給予丁苯酞注射液2mg/kg腹腔注射，假手術(shù)組和缺血組給予腹腔注射生理鹽水1mL/kg，共7 d。

1.2.2 Morris水迷宮行為學(xué)實驗：水溫保持在（24±1）℃，

池內(nèi)水深40cm，水面高出平臺的表面約2cm。平臺設(shè)在第Ⅳ象限的中央，用攝像儀監(jiān)測游泳活動連接于計算機(jī)處理分析。見圖1。

1.2.2.1 定位航行實驗：從第9天開始，小鼠每天訓(xùn)練1次，1min/次，訓(xùn)練5d。平臺對面為入池位置，大鼠置于象限邊緣1/2弧度處頭朝池壁入水，60s仍未能找到站臺者，將其引領(lǐng)到第Ⅳ象限平臺，放置10s，引導(dǎo)其學(xué)習(xí)。第2～5天重復(fù)如上操作，記錄大鼠找到平臺的時間（潛伏期）、距離及經(jīng)過平臺所在象限的次數(shù)。每次潛伏期作為學(xué)習(xí)成績，進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.2.2.2 空間探索實驗：撤去平臺后在同一位置將大鼠頭朝池壁入水，自由游泳60s。記錄在水迷宮測試中第一次到達(dá)平臺的時間和60s內(nèi)穿過平臺位置的次數(shù)，在第四象限停留時間來評估大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。

1.3 統(tǒng)計方法 采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的雙因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

缺血模型組逃避潛伏期顯著增加（與假手術(shù)組比較，P＜0.05）。見圖2。缺血模型組比假手術(shù)組在第四象限停留時間更少，腦慢性低灌注1個月后大鼠認(rèn)知功能減退。丁苯酞治療組顯著延長大鼠慢性低灌注后在第四象限的停留時間（與缺血模型組比較，P＜0.05）見圖3。計算游泳試驗速度，方差分析結(jié)果表明任何2組間均無顯著差異。見圖4。因此可消除逃避潛伏期的組間差異與游泳能力的差異有關(guān)。Morris水迷宮逃避潛伏期及第四象限停留時間用來評估空間記憶，行為學(xué)實驗結(jié)果提示丁苯酞治療組能顯著改善慢性低灌注大鼠的空間認(rèn)知功能障礙。

圖1 各組大鼠水迷宮實驗時程示意圖

圖2 各組潛伏逃避期

圖3 各組第四象限停留時間

圖4 各組游泳速度

3 討論

Morris水迷宮行為學(xué)的測試方法證實了永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈后腦慢性低灌注引起大鼠空間記憶及記憶保持能力減退。慢性腦缺血比短暫性腦缺血的改變更加明顯。這一實驗結(jié)果提示腦慢性低灌注后可導(dǎo)致空間認(rèn)知功能損害，與既往的實驗結(jié)果相符。永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈不引起腦內(nèi)大面積梗死，但可以導(dǎo)致全腦慢性低灌注的作用十分確切。

記憶鞏固過程與海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元功能密切相關(guān)，記憶中繼的過程與多突觸海馬內(nèi)環(huán)通路傳導(dǎo)有關(guān)。海馬CA1區(qū)神經(jīng)元接受來自嗅內(nèi)皮質(zhì)和副海馬嗅后皮質(zhì)的信息。CA1區(qū)突觸后信號通過海馬的下腳投射到嗅內(nèi)皮質(zhì)的深層區(qū)域，海馬CA1區(qū)缺血受損可影響海馬的輸出及中繼功能［35］，影響長程記憶。海馬的頭部是由脈絡(luò)膜前動脈來供血［67］。海馬的體部供血則依靠大腦后動脈，大腦后動脈發(fā)出的海馬前、中、后動脈最終形成了海馬動脈的縱行終末段。Kishimoto等［8-9］研究發(fā)現(xiàn)結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈后初期海馬的局部腦血流量（rCBF）下降了20％。Ohta等［10］同樣發(fā)現(xiàn)雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎術(shù)后2.5h海馬局部腦血流量下降了44％，2d下降了30％，3個月時下降了25％。全腦的低灌注會引起海馬局部腦血流的下降，在此應(yīng)激狀態(tài)下的調(diào)節(jié)反應(yīng)影響到學(xué)習(xí)記憶的海馬CA1突觸機(jī)制，發(fā)生記憶通路紊亂。丁苯酞是一種我國自主研發(fā)的新藥，是從芹菜籽中分離而得到的藥效成分。在多種天然植物如川芎、當(dāng)歸、茶芎等中均發(fā)現(xiàn)丁苯酞，具有止喘、抗驚厥等多種藥效［11］。丁苯酞現(xiàn)已廣泛用于缺血性腦血管的治療，能改善缺血區(qū)腦組織微循環(huán)、抑制缺血后自由基的產(chǎn)生，維護(hù)線粒體功能和結(jié)構(gòu)完整，并能抑制炎癥反應(yīng)，抑制神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡，因此能減輕缺血缺氧引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷。研究發(fā)現(xiàn)，丁苯酞治療阿爾茨海默模型大鼠使其海馬GFAP表達(dá)減少，增加VEGF表達(dá)［12-13］；且丁苯酞能維持海馬組織的β分泌酶的含量和活性，從而達(dá)到保護(hù)阿爾茨海默模型大鼠神經(jīng)血管單元的作用［14］。

腦慢性低灌注能引起認(rèn)知功能減退，慢性低灌注是阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制之一，本研究通過水迷宮行為學(xué)檢測證實了丁苯酞可改善大鼠慢性低灌注后空間認(rèn)知功能損害的機(jī)制可能與丁苯酞對神經(jīng)血管單元的多重保護(hù)作用有關(guān)。此外，需進(jìn)一步深入研究丁苯酞改善慢性缺血后認(rèn)知功能損害的機(jī)制，對控制慢性缺血后病情的進(jìn)展及向阿爾茨海默病的轉(zhuǎn)化具有深遠(yuǎn)的臨床意義。

［1］Sarti C，Pantoni L，Bartolini L，et al.Cognitive impairment and chronic cerebral hypoperfusion：what can be learned from experimental models［J］.J Neurol Sci，2002，15（203/204）：263-266.

［2］徐皓亮，馮亦璞.丁苯酞對局灶性腦缺血大鼠腦膜微循環(huán)障礙的影響［J］.藥學(xué)學(xué)報，1999，34（3）：172-177.

［3］Jeneson A，Squire LR.Working memory，long-term memory，and medial temporal lobe function［J］.Learn Mem，2011，19（1）：15-25.

［4］Warren DE，Duff MC，Jensen U，et al.Hiding in plain view：Lesions of the medial temporal lobe impair online representation［J］.Hippocampus，2012，22（7）：1 577-1 588.

［5］Du AT，Schuff N，Amend D.Magnetic resonance imaging of the entorhinal cortex and hippocampus in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease［J］.J Neurol Neurosurg Psychiatry，2001，71（4）：441-447.

［6］Szabo K，F(xiàn)orster A，Jger T，et al.Hippocampal lesion patterns in acute posterior cerebral artery stroke：clinical and MRI findings［J］.Stroke，2009，40（6）：2 042-2 045.

［7］Forster A，Griebe M，Gass A，et al.Diffusion-weighted imaging for the differential diagnosis of disorders affecting the hippocampus［J］.Cerebrovasc Dis，2012，33（2）：104-115.

［8］Kishimoto J，Tsuchiya T，Cox H，et al.Age-related changes of calbindin-D28k，calretinin，and parvalbumin mRNAs in the hamster brain［J］.Neurobiol Aging，1998，19（1）：77-82.

［9］Yamaguchi R，Tanimoto N，Tateyama S，et al.Immunohistochemical study of age-dependent brain lesions in mice infected intracerebrally with Kasba（Chuzan）virus［J］.J Comp Pathol，2001，124（1）：36-45.

［10］Ohta M.Changes in spatio-temporal patterns after long-term potentiation（LTP）in mouse hippocampal slices and effects of trichloroethylene on LTP［J］.Hokkaido Igaku Zasshi，1998，73（4）：365-378.

［11］鄢學(xué)芬，詹瑾，黃葉寧，等.丁苯酞的藥理作用與臨床評價［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2008，28（17）：1 498-1 500.

［12］Carmeliet P，Storkebaum E.Vascular and neuronal effects of VEGF in the nervous system：implications for neurological disorders［J］.Semin Cell Dev Biol，2002，13（1）：39-53.

［13］候德仁，薛麗，陳坤，等.丁苯酞對阿爾茨海默病模型大鼠海馬GFAP和VEGF的影響［J］.中南大學(xué)學(xué)報，2010，35（2）：111-115.

［14］陳蕓，李海洋.丁苯酞對AD大鼠模型海馬BACE及NEP活性含量的測定［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2011；9（7）：844-845.

（收稿2014-04-17）

The protective effect of butylphthalide on the cognitive function of chronic hypoperfusion rats

Wei Wei，Huang Yonghua，Zhang Weiwei
Department of Neurology，the Beijing Military General Hospital，Beijing100700，China

Objective To investigate the protective effect of butylphthalide on the cognitive function of chronic hypoperfusion rats in the bybilateral occlusion of common carotid arteries model.Methods 48Wistar rats were randomly divided into sham group，ischemia group and butylphthalide group.The spatial cognition function of rats was evaluated with Morris Water Maze Task.Results The cognitive function of rats was reduced after chronic hypoperfusion.The escape latency and the fourth quadrant residence time of butylphthalide group were longer than these of ischemia group.Conclusion Butylphthalide has the protective effect on the cognitive function of chronic hypoperfusion rats.

Dhronic cerebral hypoperfusion；Butyphthalide；Cognitive function

R-332

A

1673-5110（2015）04-0034-03

△通訊作者：黃永華，主任醫(yī)師，研究方向：眩血管病。

E-mail：nyh＠163.com