miRNA-143靶向MACC1抑制宮頸癌細胞侵襲

許常娟 鄧丹玲 丁彥青 廖雯婷

·基礎(chǔ)研究·

miRNA-143靶向MACC1抑制宮頸癌細胞侵襲

許常娟 鄧丹玲 丁彥青 廖雯婷

目的：探討miRNA-143對宮頸癌細胞侵襲能力的影響。方法：采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法瞬時轉(zhuǎn)染miRNA-143過表達和干擾質(zhì)粒，Transwell遷移實驗檢測miRNA-143過表達和抑制后宮頸癌細胞侵襲能力的改變，生物信息學(xué)預(yù)測miRNA-143的作用靶點。miRNA-143過表達和抑制后Western blot及雙熒光素酶報告基因檢測其靶點MACC1表達，RT-qPCR檢測20例患者宮頸癌和癌旁正常組織標本中miRNA-143和MACC1 mRNA的表達，分析20例患者宮頸癌組織中miRNA-143和MACC1 mRNA表達的相關(guān)性。結(jié)果：Transwell遷移實驗顯示miRNA-143過表達的宮頸癌細胞的侵襲能力降低，抑制miRNA-143后侵襲能力增強。生物信息學(xué)預(yù)測顯示miRNA-143作用于MACC1的3'-UTR，Western blot及雙熒光素酶報告基因結(jié)果進一步證實miRNA-143作用于MACC1的3'-UTR。RT-qPCR顯示miRNA-143過表達的MACC1 mRNA表達下降，而抑制miRNA-143后MACC1 mRNA表達上升。抑制miRNA-143表達的宮頸癌細胞中MACC1被干擾后，宮頸癌細胞的侵襲能力顯著被抑制。宮頸癌組織中miRNA-143表達水平顯著低于正常宮頸上皮組織，MACC1表達水平顯著高于正常宮頸上皮組織，20例患者的宮頸癌組織中miRNA-143與MACC1 mRNA表達呈負相關(guān)。結(jié)論：miRNA-143在宮頸癌中表達水平下降，并可能通過靶向MACC1調(diào)節(jié)宮頸癌細胞的侵襲能力。

宮頸癌 miRNA-143侵襲 MACC1

宮頸癌（cervical cancer）是女性常見的惡性腫瘤之一，嚴重危害人類健康。宮頸癌發(fā)病的高危因素主要為人乳頭瘤病毒（human papillomaviruses，HPVs）感染，大部分宮頸癌患者體內(nèi)可檢測到HPV DNA。

在發(fā)展中國家，盡管宮頸癌細胞學(xué)篩查的廣泛開展使宮頸癌的發(fā)生率和死亡率有所下降，但其發(fā)生率和死亡率仍居女性惡性腫瘤的第2位。因此，宮頸癌應(yīng)成為女性重點預(yù)防的惡性腫瘤。研究表明，微小RNA（microRNA，miRNA）與多種惡性腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［1-2］。在宮頸癌中已發(fā)現(xiàn)數(shù)種表達失調(diào)的miRNA，包括miRNA-21、miRNA-126等［3］。近期有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-143在宮頸鱗癌中表達下調(diào)，其表達水平與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及HPV16的感染密切相關(guān)［4］。然而，miRNA-143在宮頸癌中作用和分子機制尚在研究中。本研究旨在探討miRNA-143在宮頸癌細胞侵襲中的作用，并初步探討其分子機制，明確miRNA-143是否通過靶向MACC1而調(diào)控宮頸癌的侵襲轉(zhuǎn)移，為宮頸癌轉(zhuǎn)移的臨床干預(yù)治療提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本 收集2012年12月至2013年10月取自南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院20例手術(shù)患者的宮頸癌和癌旁正常組織標本，標本置于液氮保存。患者標本使用獲得本院倫理委員會認可。

1.1.2 細胞株 人宮頸癌細胞株SiHa和Caski為南方醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)實驗室自存。

1.1 3 實驗試劑 胎牛血清、RPMI 1640（美國Gibco公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq HS酶、Trizol試劑（日本Taraka公司），LipofectamineTM2000試劑盒（美國Invit?rogen公司），PVDF膜（美國Millipor公司），miRNA-143過表達、miRNA-143抑制和All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR檢測試劑盒（美國Genecopoeia公司），雙熒光素酶檢測試劑盒（美國Promega公司），Snail兔抗人單克隆抗體（美國Cell signaling公司），Transwell小室（美國BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人宮頸癌細胞株SiHa和Caski在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞接種于6孔板，設(shè)置陰性對照（negative control，NC）轉(zhuǎn)染組、miR?NA-143過表達和miRNA-143轉(zhuǎn)染抑制組。基因轉(zhuǎn)染步驟參照LipofectamineTM2000試劑盒說明書進行，轉(zhuǎn)染后48 h裂解細胞，收集RNA和蛋白分別進行下一步檢測。

1.2.2 組織總RNA提取 取新鮮宮頸癌及癌旁正常組織，在液氮中研磨后加Trizol試劑裂解，按常規(guī)方法提取組織RNA，并測定RNA濃度。

1.2.3 RT-qPCR檢測組織及細胞中miRNA-143表達 采用miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄，利用特異的引物，進行RT-qPCR檢測。反應(yīng)條件為50℃2 min、95℃10 min、95℃15 s、60℃1 min、72℃34 s，共行40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后得到Ct值。根據(jù)公式2-（miRNA-143的Ct值－U6的Ct值）計算目的基因相對含量，實驗重復(fù)3次。

1.2.4 Transwell遷移實驗 細胞轉(zhuǎn)染24 h后消化、計數(shù)，加入放置Transwell小室的24孔板中，上層小室加入含5%胎牛血清的培養(yǎng)基，下層加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，孵育48 h后取出、固定、染色，顯微鏡下隨機選取視野拍照計數(shù)，實驗重復(fù)3次。

1.2.5 Western blot法檢測 miRNA-143過表達或抑制后MACC1表達采用陽離子脂質(zhì)體Lipofectami?neTM2000瞬時轉(zhuǎn)染MACC1的干擾序列shMACC1#1和shMACC1#2，48 h后提取細胞總蛋白，蛋白采用10% SDS-PAGE凝膠行電泳分離，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，結(jié)束后使用兔抗人的MACC1單克隆抗體孵育過夜，次日加入辣根過氧化物酶標記的二抗，于室溫孵育45 min后洗脫抗體，常規(guī)顯色發(fā)光。

1.2.6 載體構(gòu)建PGL3-MACC1的3'-UTR-WT 以人宮頸癌細胞基因組DNA為模板，擴增MACC1的3'-UTR，將該片段克隆至PGL3-Basic載體，經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、小量提取、測序鑒定得到種族質(zhì)粒PGL3-MACC1的3'-UTR-WT。

1.2.7 設(shè)計重組質(zhì)粒PGL3-MACC1的3'-UTR突變體 以人宮頸癌細胞基因組DNA為模板，擴增突變序列，將突變序列片段克隆至PGL3-Basic載體，經(jīng)雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化、搖菌、質(zhì)粒提取、測序鑒定得到突變質(zhì)粒PGL3-MACC1的3'-UTR-MUT。

1.2.8 雙熒光素酶報告基因檢測實驗 SiHa轉(zhuǎn)染前24 h消化和計數(shù)細胞，在24孔板中接種5×104/mL細胞，待細胞達到60%匯合進行轉(zhuǎn)染。按Lipofectami?neTM2000說明書操作。轉(zhuǎn)染分為過表達+PGL3-Basic載體、過表達+3'-UTR-WT、過表達+3'-UTR-MUT組，設(shè)3個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染后按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書進行操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。兩組計量資料采用非參數(shù)Wilcoxon符號秩檢驗，均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，各組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌細胞中miRNA-143過表達和抑制后表達

RT-qPCR結(jié)果顯示，與陰性對照轉(zhuǎn)染組比較，在宮頸癌SiHa細胞中瞬時轉(zhuǎn)染過表達miRNA-143，miRNA-143表達升高，陰性對照轉(zhuǎn)染組和miRNA-143過表達組的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.002）；在宮頸癌Caski細胞中轉(zhuǎn)染抑制miRNA-143，miRNA-143表達明顯下降，陰性對照轉(zhuǎn)染組和miRNA-143轉(zhuǎn)染抑制組的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001），見圖1。

2.2 miRNA-143過表達和抑制后宮頸癌細胞侵襲遷移能力的改變

Transwell遷移實驗結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，宮頸癌SiHa細胞的miRNA-143過表達使遷移的細胞明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001，圖2A）；在宮頸癌Caski細胞中抑制miRNA-143后遷移的細胞明顯增多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001，圖2B）。miRNA-143過表達使細胞的遷移能力明顯減弱，而抑制miRNA-143后細胞的遷移能力明顯增強。

2.3 miRNA-143作用靶點的預(yù)測及驗證

miRNA靶基因預(yù)測軟件Target Scan發(fā)現(xiàn)miRNA-143能作用于MACC1的3'-UTR（圖3A）；雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示共轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒MACC1的3'-UTRMUT、MACC1的3'-UTR-WT以及miRNAs后，與MACC1的3'-UTR-MUT相比，MACC1的3'-UTR-WT和miRNAs共轉(zhuǎn)染后MACC1的熒光素酶活性降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.002，圖3B）；RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)miRNA-143過表達使MACC1表達明顯下降，反之抑制miRNA-143后MACC1表達升高（圖3C）。

2.4 MACC1介導(dǎo)miRNA-143調(diào)節(jié)宮頸癌細胞的侵襲能力

宮頸癌Caski細胞中轉(zhuǎn)染miRNA-143抑制劑后轉(zhuǎn)染MACC1的干擾序列shMACC1#1和shMACC1#2，并觀察其侵襲能力的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA-143均能有效抑制細胞中MACC1表達（圖4A）；MACC1的表達被抑制后，細胞的侵襲能力顯著減弱（圖4B）。

圖1 RT-qPCR檢測轉(zhuǎn)染miRNA-143過表達和抑制后表達Figure 1 RT-qPCR was used to test the expression of miRNA-143 after transfection with miRNA-143 mimics and inhibitor

圖2 Transwell遷移實驗檢測miRNA-143過表達和抑制后宮頸癌細胞遷移能力的改變（H&E×20）Figure 2 Transwell invasion assay was used to detect the migration in cervical cancer cells after miRNA-143 over-expression or knockdown(H&E×20)

圖3 驗證miRNA-143的作用靶點及檢測MACC1的改變Figure 3 Verification of miRNA-143 target and measurement of MACC1 expression

圖4 MACC1介導(dǎo)miRNA-143調(diào)節(jié)宮頸癌細胞的遷移能力（H&E×20）Figure 4 MACC1 is necessary for the regulation of miRNA-143 in the invasion of cervical cancer（H&E×20）

2.5 miRNA-143與MACC1在宮頸癌組織中表達水平的檢測

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，20例患者的宮頸癌組織中miRNA-143相對表達的中位數(shù)為2.078 7，而癌旁正常組織中miRNA-143相對表達中位數(shù)為3.546 8，采用配對樣本的Wilcoxon符號秩檢驗，癌組織中miRNA-143表達量明顯降低，兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001，圖5A）；癌組織中MACC1相對表達的中位數(shù)為0.423 7，而癌旁正常組織中MACC1相對表達中位數(shù)為0.187 3，采用配對樣本的Wilcoxon符號秩檢驗，癌組織中MACC1表達量明顯升高，兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001，圖5B）。進一步采用免疫組織化學(xué)法對MACC1的表達進行驗證，發(fā)現(xiàn)MACC1主要在胞漿內(nèi)表達，且MACC1在宮頸癌組織中表達明顯高于癌旁組織（圖5C、D）。采用Spearman分析發(fā)現(xiàn)，20例患者的宮頸癌組織中miRNA-143表達與MACC1 mRNA表達水平呈負相關(guān)（r=-0.615，P= 0.004，圖5E）。

圖5 20例患者的宮頸癌組織及癌旁正常組織中miRNA-143與MACC1表達及相關(guān)性分析Figure 5 Correlation analyses of miRNA-143 and MACC1 expression in the primary cervical cancer and para-neoplastic normal tissues of 20 patients

3 討論

隨著世界范圍內(nèi)宮頸細胞學(xué)篩查的廣泛應(yīng)用，目前宮頸癌的發(fā)病率和死亡率均呈現(xiàn)下降趨勢。此外，針對HPV的宮頸癌預(yù)防性腫瘤疫苗的開發(fā)和臨床應(yīng)用，使未來20～30年間宮頸癌將可能得到有效的控制。但是，目前宮頸癌的治療策略尚未取得較大進展，尤其是針對晚期伴有轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者。因此，積極探索宮頸癌發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移的分子機制具有重要的現(xiàn)實價值和理論意義。

miRNA-143定位于人類染色體5q32脆弱位點，成熟序列為5′-UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC-3′，其在多種實體瘤中表達下調(diào)或缺失，包括結(jié)直腸癌、前列腺癌、胃癌、膀胱癌和B細胞淋巴瘤等［5］。研究報道，miRNA-143的靶點基因包括KRAS、MACC1和Bcl-2等［6-8］，這些基因參與了ERK和MAPK信號通路，其中Stein等［9］證實MACC1是HGF-cMet信號通路中的一個關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可以顯著上調(diào)cMet蛋白的表達，促進惡性腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。該研究已證實MACC1基因與HGF-cMet信號通路之間呈正相關(guān)，HGF促進MACC1入核，MACC1啟動cMet基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致cMet蛋白總量表達增加，進而結(jié)合更多的HGF分子，從而增強HGF-cMet信號通路活性。

Lajer等［10］發(fā)現(xiàn)miRNA-143/miRNA-145可能參與宮頸癌HPV相關(guān)的病變過程。Wang等［11］發(fā)現(xiàn)miRNA-143在宮頸癌組織中表達下調(diào)，在宮頸癌HeLa細胞中miRNA-143過表達能抑制細胞增殖。然而，miRNA-143在宮頸癌細胞侵襲中作用尚不清楚。本研究結(jié)果提示，miRNA-143在宮頸癌中表達下調(diào)，在宮頸癌細胞中miRNA-143過表達能抑制宮頸癌細胞的侵襲能力，并下調(diào)MACC1表達；反之在宮頸癌細胞中抑制miRNA-143表達，則能增強宮頸癌細胞的侵襲能力，并上調(diào)MACC1表達。MACC1是一個與結(jié)腸癌浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因，在調(diào)節(jié)細胞增殖、運動和遷移等方面發(fā)揮著重要的作用［12］。目前已證實MACC1基因是HGF-cMet信號通路的一個關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，MACC1在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中起了十分重要的作用［9］。有研究表明，MACC1在宮頸癌中表達水平升高［13］，然而其調(diào)控機制尚未明確。本研究結(jié)果表明MACC1的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平表達均在宮頸癌組織中升高，與之前文獻報道的結(jié)果相符［13］。同時，本研究證實在宮頸癌細胞中miRNA-143能靶向作用于MACC1的3'-UTR，下調(diào)MACC1表達。進一步的研究顯示，在宮頸癌組織中miRNA-143與MACC1表達呈負相關(guān)。這些結(jié)果提示，在宮頸癌中miRNA-143可能通過直接作用于其靶分子MACC1從而抑制宮頸癌細胞的侵襲。

綜上所述，本研究結(jié)果表明miRNA-143在宮頸癌組織中低表達，miRNA-143能調(diào)控MACC1從而抑制宮頸癌細胞的侵襲，為miRNA作為宮頸癌轉(zhuǎn)移新的標志物提供科學(xué)依據(jù)，對于宮頸癌轉(zhuǎn)移的臨床干預(yù)治療具有重要意義。

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（2015-07-01收稿）

（2015-09-09修回）

Inhibitory effect of miRNA-143 on the invasiveness of cervical cancer cells by targeting MACC1

Changjuan XU,Danling DENG,Yanqing DING,Wenting LIAO

Department of Pathology,Southern Medical University School of Basic Medical Sciences,Guangzhou 510515,China

Objective:To illustrate the role of miRNA-143 on the invasiveness of cervical cancer cells.Methods:MiRNA-143 mimics or inhibitor sequences were transiently expressed in the cervical cancer cells by liposome transfection.Transwell assay was applied to test the invasive ability of cervical cancer cells after miRNA-143 over-expression or inhibition.Bioinformatics assay was used to predict the targets of miRNA-143.RT-qPCR and luciferase reporter assay were performed to detect the expression of MACC1 mRNAin the cancer cells.RT-qPCR was conducted to test the expression of miRNA-143 and MACC1 mRNAin 20 fresh primary cervical cancer and their matched para-neoplastic tissues.Statistical analyses were performed to evaluate the association between the expression of miRNA-143 and MACC1 mRNA in the 20 cases of cervical cancer.Results:Transwell assays revealed that the miRNA-143 over-expression inhibited the cell invasiveness,while miRNA-143 inhibition promoted the invasive ability of the cervical cancer cells. Bioinformatics analyses revealed that miRNA-143 could target the 3'-UTR of MACC1.Dual luciferase reporter assay confirmed that miRNA-143 can affect 3'-UTR sequence in MACC1 genes.RT-qPCR analyses indicated that the expression of MACC1 mRNA was obviously down-regulated after miRNA-143 over-expression,while significantly increased after the miRNA-143 inhibition.The migration in Caski/miRNA-143 inhibitor cells was obviously elevated after being transfected with MACC1 shRNAs.RT-qPCR analyses showed that the expression of miRNA-143 was obviously decreased in the cancer tissues compared with the normal tissues,while MACC1 mRNA was apparently decreased in cancer tissues compared with the normal ones.Statistical analyses revealed that miRNA-143 was negatively correlated with MACC1 mRNA in the 20 cases of cervical cancer.Conclusion:This study reveals that miRNA-143 is downregulated in the cervical cancer tissues.MiRNA-143 may play an important role in the regulation of cell invasiveness by targeting MACC1 in the cervical cancer cells.

cervical cancer,miRNA-143,invasiveness,MACC1

10.3969/j.issn.1000-8179.2015.18.709

南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理系（廣州市510515）

廖雯婷 liaowt2002@gmail.com

許常娟 專業(yè)方向為腫瘤病理學(xué)。

E-mail：15629906@qq.com