c-met在新疆哈薩克族與漢族食管鱗癌組織及血清中的表達及意義

王興名，郭莉，張志強，張園，程文霞，王洪江△

c-met在新疆哈薩克族與漢族食管鱗癌組織及血清中的表達及意義

王興名1，郭莉2，張志強1，張園3，程文霞4，王洪江1△

目的探討新疆哈薩克族（哈族）與漢族食管鱗癌患者組織及血清中c-met蛋白的表達及其與臨床病理特征的關系。方法收集哈族和漢族食管鱗癌組織及其對應的癌旁食管組織各50例，采用免疫組織化學法檢測組織中c-met蛋白的表達；取以上食管鱗癌患者血清標本，另擇哈族和漢族健康體檢者血清各40例，采用酶聯免疫吸附（ELISA）法測定血清中c-met蛋白的含量。結果c-met蛋白在哈族和漢族食管鱗癌組織中的陽性表達率分別高于其對應的癌旁組織，且c-met蛋白在哈族和漢族食管鱗癌患者血清中的含量均分別高于其對應的健康體檢者。食管鱗癌組織和血清中，c-met蛋白表達在不同腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期間差異有統計學意義，其中浸潤至深肌層及突破漿膜（T3+T4）高于浸潤黏膜及黏膜下層組（T1+T2），有淋巴結轉移高于無淋巴結轉移，TNM分期ⅡB+Ⅲ期高于Ⅰ+ⅡA期；c-met蛋白表達在不同民族、性別、年齡、組織分化程度間的差異均無統計學意義。結論cmet蛋白與哈族和漢族食管鱗癌的發生發展、浸潤、轉移及分期均有關，其在食管鱗癌組織和血清中的高表達，可能預示食管癌易浸潤轉移，并提示臨床分期較晚。

食管腫瘤；癌，鱗狀細胞；原癌基因蛋白質c-met；免疫組織化學；酶聯免疫吸附測定

新疆哈薩克族（哈族）食管癌發病率明顯高于漢族[1-2]，且以食管鱗狀細胞癌（ESCC）為主。c-met蛋白是原癌基因c-met（prpto-oncogne c-met）表達產生的一種跨膜糖蛋白。多項研究顯示，c-met蛋白的高表達與腫瘤的發生、發展及浸潤性有關[3]，但該蛋白在哈族和漢族食管鱗癌患者民族間表達差異的研究并不多見，并且該蛋白在食管鱗癌患者血清中表達水平的研究也不多見。本研究采用免疫組織化學法檢測新疆哈族和漢族食管鱗癌患者癌組織與對應癌旁組織c-met蛋白的表達程度，酶聯免疫吸附（ELISA）法檢測食管鱗癌患者及健康體檢者血清中該蛋白表達量，并分析c-met蛋白與兩民族食管鱗癌發生、發展、浸潤及轉移等臨床病理特征的關系。

1 材料與方法

1.1 材料收集2010年1月—2012年12月新疆醫科大學附屬腫瘤醫院胸外科手術切除標本100例，每例患者均取得遠隔癌旁組織作為對照，所選病例術后病理均證實為食管鱗狀細胞癌。其中漢族和哈族各50例，漢族年齡41～77歲，平均（57.00±3.06）歲；哈族年齡38～80歲，平均（58.00±2.17）歲；根據食管癌分期2010年(AJCC第七版）分期標準，術后分期Ⅰ期10例，ⅡA期17例，ⅡB期27例，ⅢA期26例，ⅢB期11例，ⅢC期9例；其中有、無淋巴結轉移各50例。所選入組的患者術前均未行放療及化療。上述食管鱗癌患者血清標本由新疆腫瘤防治研究所標本庫提供，另選擇漢族和哈族健康體檢者血清各40份作為健康對照，其中漢族和哈族男女性別比例均為1∶1，漢族年齡35～70歲，平均（55.38±4.49）歲，哈族年齡35～79歲，平均（57.81±5.86）歲。食管鱗癌患者與健康體檢者的年齡（t=1.102）、性別（χ2= 1.147）差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

1.2 標本處理所有組織標本術中離體30 min內立即取材，取遠隔5 cm以上癌旁食管組織作為對照，10%福爾馬林固定，石蠟包埋，用于常規病理診斷及免疫組織化學染色。血清標本均為患者術前晨空腹靜脈血，未加抗凝劑，30 min內送新疆腫瘤防治研究所標本庫并立即處理，3 000 r/min離心10 min，分裝后于-80℃冰箱凍存備用；健康體檢者血清采集、保存方法同上。

1.3 主要試劑及儀器c-met兔抗人單克隆抗體、通用二抗、SP試劑盒及DAB顯色劑均購自北京中杉金橋生物科技有限公司；Human c-met ELISA kit（EK0744）購自武漢博士德生物科技有限公司；美國Bio-rad酶標儀；德國Ditabis恒溫振蕩器；德國sigma高速離心機。

1.4 實驗操作（1）免疫組織化學法。將標本蠟塊制成4 μm厚連續石蠟切片。二甲苯脫蠟，水化；用3%H2O2乙醇溶液消除內源性過氧化物酶，高壓法抗原修復，山羊血清進行封閉。切片采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法（S-P法）染色。c-met抗體的工作濃度為1∶100。選用已知陽性食管癌組織切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照，染色步驟嚴格按照產品說明書進行。（2）ELISA法。凍存標本在室溫下緩慢平衡至室溫；設置空白孔、標準品孔和待測標本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品；樣本孔中加入待測樣本，空白孔不加；除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體，用封板膜封住反應孔，37℃恒溫孵育。洗板，每孔加入底物，37℃避光孵育。滴加終止液并立即在450 nm波長處測定各孔的OD值。詳細操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.5 結果判讀（1）免疫組織化學結果。由2名病理專業醫師在在完全不了解組織切片臨床和病理資料情況下判讀，并高倍鏡下隨機讀取5個視野，每個視野觀察細胞數不小于200個。c-met蛋白陽性表達定位于胞漿和（或）胞膜，陽性信號呈黃色、棕黃色、棕褐色顆粒樣物質。根據陽性細胞比例（A）及染色強度（B）進行陽性程度的判斷[4-5]。A判斷標準為同一視野下陽性細胞數占同類細胞數的百分率，陽性細胞數＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%以上為4分；B判讀標準：淡棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。以A×B結果作為c-met蛋白表達程度，乘積≤2為陰性（-），＞2分為陽性（+）。（2）ELISA結果。使用美國Bio-rad酶標儀，在450 nm波長處測定各孔的OD值，并連接計算機繪制標準曲線，求得待測樣本中c-met蛋白含量值。

1.6 統計學方法應用SPSS 16.0軟件進行統計分析，c-met蛋白在組織中陽性表達率之間的比較用χ2檢驗；c-met蛋白在血清中含量用表示，兩獨立樣本間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 c-met蛋白在食管鱗癌組織和癌旁組織中的表達c-met蛋白在食管鱗癌組織及癌旁食管組織中的陽性表達定位于細胞膜或細胞漿，在癌組織中的染色呈彌漫分布，并可見少量淋巴細胞及血管內皮細胞，胞漿呈棕黃色；癌旁組織中染色主要位于基底細胞層，細胞排列整齊。見圖1、2。c-met蛋白在哈族和漢族食管鱗癌組織中的陽性表達率均分別高于其在癌旁組織中的陽性表達率（均P＜0.01），見表1。

Fig.1The positive expression of c-met in esophageal squamous cell carcinoma(×100)圖1 c-met在食管鱗癌組織中的陽性表達（×100）

Fig.2The positive expression of c-met in the adjacent tissues of carcinoma(×100)圖2 c-met在癌旁組織中的陽性表達（×100）

Tab.1Comparison of the expression of c-met protein between esophageal squamous cell carcinoma and the adjacent tissues of carcinoma in Kazakh and Han people表1 c-met蛋白在哈族和漢族食管鱗癌組織及癌旁組織中的陽性表達比較例（%）

2.2 食管鱗癌患者及健康體檢者血清c-met蛋白水平比較哈族和漢族食管鱗癌患者血清c-met蛋白水平均分別高于其對應的健康體檢者（均P＜0.01），見表2。

Tab.2Comparison of serum c-met protein between esophageal squamous cell carcinoma patients and healthy subjects表2 哈族和漢族食管鱗癌患者及健康體檢者血清c-met蛋白水平比較（μg/L，）

Tab.2Comparison of serum c-met protein between esophageal squamous cell carcinoma patients and healthy subjects表2 哈族和漢族食管鱗癌患者及健康體檢者血清c-met蛋白水平比較（μg/L，）

＊＊P＜0.01

組別食管鱗癌患者健康體檢者t n 50 40哈族108.59±11.01 63.25±9.10 21.384＊＊漢族106.39±10.74 63.25±9.10 20.610＊＊

2.3 c-met蛋白表達與食管鱗癌患者臨床病理特征間的關系無論是在食管鱗癌組織中還是在血清中，c-met蛋白表達在不同腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期間差異有統計學意義，其中浸潤至深肌層及突破漿膜（T3+T4）高于浸潤黏膜及黏膜下層組（T1+T2），有淋巴結轉移高于無淋巴結轉移，TNM分期ⅡB+Ⅲ期高于Ⅰ+ⅡA期；c-met蛋白表達在不同民族、性別、年齡、組織分化程度間的差異均無統計學意義，見表3。

Tab.3The relationship between c-met protein and clinic pathological significance表3 c-met蛋白表達與臨床病理特征的關系

3 討論

c-met蛋白是原癌基因c-met轉錄翻譯生成的一種跨膜糖蛋白，具有酪氨酸激酶活性，同時也是肝細胞生長因子（HGF）的受體[3]。該蛋白含有α、β兩個亞基，兩亞基通過二硫鍵連接形成異二聚體，α亞基位于胞外，β亞基跨膜，由于功能的不同分為3個結構域：細胞內結構域、跨膜結構域和細胞外結構域。其中細胞外結構域（β亞基胞外區和α亞基）是配體識別部位，可以特異性識別并結合配體（HGF）。而胞內結構域為β亞基C端（位于細胞內），其具有酪氨酸激酶的活性，是多種信號分子相互作用的共同結合部位[6]。當配體HGF與c-met受體結合后[7]，細胞外β亞基的相應位點被激活，信號傳導入胞內，使酪氨酸激酶（PTK）激活，從而導致cmet受體自身酪氨酸殘基（Tyr）磷酸化[8]，同時啟動多種信號通路，如PI3K/Akt信號通路[9]、Ras和ERK/MAPK信號通路[10]等，從而促進細胞的分化、分裂，并能夠調節多種器官組織的生長、發育，同時修復組織損傷。

本研究結果顯示，c-met蛋白在哈族和漢族食管鱗癌組織中的陽性表達率均分別高于其對應的癌旁組織，且c-met蛋白在哈族和漢族食管鱗癌患者血清中的水平均分別高于其對應的健康體檢者。提示該蛋白的表達與兩民族食管鱗癌發生有關，這與劉春濤等[11]的研究結果基本一致。胡亮等[12]采用納米免疫磁珠方法檢測c-met蛋白在胰腺癌患者外周血清中表達時，也發現外周血c-met蛋白表達陽性；周韻斕等[13]通過RT-PCR方法檢測胃癌患者外周血細胞游離核酸標志物的研究中，發現胃癌患者外周血中c-met mRNA含量高于健康對照組。因此可以推測c-met蛋白的高表達與食管鱗癌發生存在密切關系，c-met蛋白在血清中的高表達可能提示兩民族食管鱗癌高發生、高復發風險。

在腫瘤的發生、發展中，新生血管形成起至關重要的作用。c-met基因過度表達還可以促進新生血管形成和基底膜破壞，促進惡性腫瘤的侵襲和轉移。而在HGF/c-met信號系統中，HGF不僅可以通過自分泌或旁分泌方法直接作用內皮細胞，促進腫瘤新生血管形成，還可以通過影響其他血管生長因子的水平，間接促進腫瘤的血管生成[7]。Grugan等[14]研究發現通過增加HGF/c-met信號系統中HGF血液中的含量，可以促進基底膜的破壞，加速惡性腫瘤的侵襲和轉移。

另外本研究發現，c-met蛋白在組織和血清中的高表達與腫瘤的浸潤深度、淋巴結轉移及TNM分期有關。浸潤至深肌層及突破漿膜組（T3+T4）該蛋白在組織和血清中的含量均高于浸潤黏膜及黏膜下層組（T1+T2）；有淋巴結轉移組該蛋白在組織和血清中的含量均高于無淋巴結轉移組，提示該蛋白的高表達與食管鱗癌的侵襲性、轉移性有關，其表達程度越高，提示侵襲性、轉移性風險越大。并且隨TNM分期越晚，該蛋白陽性表達程度及血清含量越高，提示該蛋白的高表達可能對食管鱗癌的TNM分期有一定影響。c-met蛋白在血清中的含量可能在一定程度上反映浸潤深度、淋巴結轉移及病期早晚，且c-met在血清中的檢測較組織切片中檢測更加方便，并能在術前早期篩檢。

綜上所述，c-met蛋白與哈族和漢族食管鱗癌的發生發展、浸潤轉移均有關；c-met蛋白在食管鱗癌組織和血清中的的高表達可能預示食管鱗癌易浸潤轉移，并提示臨床分期較晚；該蛋白在組織及血清中的陽性表達可以作為食管鱗癌高轉移性、侵襲性的分子標志物之一，而在血清中的檢測更加方便，有望成為早期篩檢指標之一。

[1]Zheng S,Vuitton L,Sheyhidin I,et al.Northwestern China:a place to learn more on oesophageal cancer.Part one:behavioural and environmental risk factors[J].Eur J Gastroenterol Hepatol,2010,22(8): 917-925.doi:10.1097/MEG.0b013e3283313d8b.

[2]Ma H,Ayxiam·HSM,Ilyar.XHD,et al.Clinicopathological Data Retrospective Analysis of 2863 Patients with Esophageal Carcinoma from Different Nationalities in Xinjiang Area[J].Cancer Research on Prevention and Treatment,2013,40(9):853-855.[馬紅,阿仙姑·哈斯木,伊力亞爾·夏合丁，等.新疆地區不同民族2863例食管癌患者臨床病理資料回顧性分析[J].腫瘤防治研究,2013,40(9):853-855].doi:10.3971/j.issn.1000-8578.2013.09.008.

[3]Hou L,Zhao MM,Sun BM,et al.Expression of c-Met protein in gastrointestinal tumors:Recent research progress[J].World Chinese Journal of Digestology,2013,21(30):3230-3235.[侯雷,趙明明,孫寶明,等.c-Met蛋白在消化系腫瘤中表達的研究進展[J].世界華人消化雜志,2013,21(30):3230-3235].doi:10.11569/wcjd.v21. i30.3230.

[4]Merritt WM,Kamat AA,Hwang JY,et al.Clinical and biological impact of EphA2 overexpression and angiogenesis in endometrial cancer[J].Cancer Biol Ther,2010,10(12):1306-1314.

[5]Franklin S,Pho T,Abreo FW,et al.Detection of the proto-oncogene eIF4E in larynx and hypopharynx cancers[J].Arch Otolaryngol Head Neck Surg,1999,125(2):177-182.

[6]Zaanan A,Laurent-Puig P,Taieb J.MET signalling pathway and its therapeutic implications in gastrointestinal cancers[J].Bull Cancer, 2014,101(1):25-30.doi:10.1684/bdc.2013.1870.

[7]Shu MJ,Guo SR.Research progress of c-met signaling pathway and antagonists[J].Journal of Shanghai Jiaotong University(Medical Science),2013,33(8):1167-1170.[舒孟軍,郭圣榮.c-Met信號通路及其抑制劑的研究進展[J].上海交通大學學報(醫學版),2013,33 (8):1167].doi:10.3969/j.issn.1674-8115.2013.08.027.

[8]Eder JP,Vande WGF,Boerner SA,et al.Novel therapeutic inhibitors of the c-Met signaling pathway in cancer[J].Clin Cancer Res, 2009,15(7):2207-2214.doi:10.1158/1078-0432.CCR-08-1306.

[9]Matsumura A,Kubota T,Taiyoh H,et al.HGF regulates VEGF expression via the c-Met receptor downstream pathways,PI3K/Akt, MAPK and STAT3,in CT26 murine cells[J].Int J Oncol,2013,42 (2):535-542.doi:10.3892/ijo.2012.1728.

[10]Wang J,Gui Z,Deng L,et al.c-Met upregulates aquaporin 3 expression in human gastric carcinoma cells via the ERK signalling pathway[J].Cancer Lett,2012,319(1):109-117.doi:10.1016/j.canlet.2011.12.040.

[11]Liu CT,Zhu ST,Tian Y,et al.c-Met expression in esophageal squamous cell carcinoma tissues and its correlation with clinicopathological characteristics[J].Journal of Capital Medical University,2012, 33(2):223-226.[劉春濤,朱圣韜,田月，等.c-Met在食管鱗狀細胞癌組織中的表達及其與臨床病理的相關性[J].首都醫科大學學報,2012,33(2):223-226].doi:10.3969/j.issn.1006-7795.2012.02.018

[12]Hu L,Zhou JH,Yu ZQ,et al.Clinical significance of h-TERT and c-Met expression in the peripheral blood circulation of pancreatic cancer patients[J].Chin J Clin Oncol,2013,40(4):208-211.[胡亮,周家華,余澤前，等.胰腺癌患者外周血循環c-met和h-TERT表達的臨床意義[J].中國腫瘤臨床,2013,40(4):208-211].doi: 10.3969/j.issn.1000-8179.2013.04007

[13]Zhou YL,Dou M,Yang R,et al.Detection and application of cell-free nucleic acid biomarkers for diagnosis of gastric cancer[J].Journal of Diagnostics Concepts&Practice,2013,12(1):57-61.[周韻斕,竇敏,楊蓉,等.胃癌患者外周血細胞游離核酸標志物的檢測和應用[J].診斷學理論與實踐,2013,12(1):57-61].doi:10.3969/j. issn.1671-2870.2013.01.013.

[14]Grugan KD,Miller CG,Yao Y,et al.Fibroblast-secreted hepatocyte growth factor plays a functional role in esophageal squamous cell carcinoma invasion[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2010,107(24): 11026-11031.doi:10.1073/pnas.0914295107.

（2014-08-10收稿2014-09-26修回）

（本文編輯陳麗潔）

The expression and significance of serum c-met in esophageal squamous cell carcinoma of two different nationalities in Xinjiang

WANG Xingming1,GUO Li2,ZHANG Zhiqiang1,ZHANG Yuan3,CHENG Wenxia4,WANG Hongjiang1△
1 Thoracic Surgery,Affiliated Tumor Hospital of Xinjiang Medical University,Urumchi 830011,China;2 Medical Department,Affiliated Tumor Hospital of Xinjiang Medical University;3 Xinjiang Research Institution of Cancer Prevention;4 Fifth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Division of Chemotherapy△

ObjectiveTo explore the relationship between serum expression of c-met protein and clinic pathological features in esophageal squamous cell carcinoma(ESCC)of Kazakh and Han people.MethodsA total of 50 samples of ESCC and its corresponding adjacent tissues of Kazak and Han patients were collected.The expression of c-met protein was detected by immunohistochemistry assay.The serum c-met protein was detected in 40 Kazak and Han ESCC samples and 40 Kazak and Han controls using ELISA method.ResultsThe positive expression rates of c-met protein were higher in Kazak and Han esophageal squamous cell carcinoma patients than those in its corresponding adjacent tissues respectively.And the serum expression rates of c-met protein were higher in Kazak and Han esophageal squamous cell carcinoma patients than those of healthy controls.There were significant differences in the different tumor invasion,lymph node metastasis and TNM stage of esophageal squamous cell carcinoma tissue and serum between groups,in which the infiltrated deep muscle and serous breakthrough(T3+T4)were higher than the infiltration of the mucosa and submucosa group(T1+T2),with lymph node metastasis was higher than that without lymph node metastasis,and TNM stage ofⅡB+Ⅲwas higher than that ofⅠ+ⅡA. There was no significant difference in the expression of c-met protein between ethnicity,gender,age and degree of differentiation.ConclusionThe c-met protein expression is related to the occurrence and development,the invasion,metastasis and TNM stage of ESCC in Kazak and Han nationalities.The high expression of c-met protein in tissue and serum may indicate the invasion and metastasis of esophageal cancer and prompt a late clinical stage.

esophageal neoplasm;carcinoma,squamous cell;proto-ontogeny proteins c-met;immunohistochemistry; enzyme-linked immunosorbent assay

R735.1

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2015.01.017

國家自然科學基金項目（81160271）

1新疆醫科大學附屬腫瘤醫院胸外科（郵編830011），2內三科；3新疆腫瘤防治研究所；4新疆醫科大學第五附屬醫院放化療科

王興名（1987），男，碩士在讀，主要從事食管癌外科治療與基礎研究

△通訊作者E-mail：whj71210@sina.com