瀕危植物七指蕨的孢子萌發(fā)和光合特性研究

宋莉英，李曉娜，潘曉婷

（廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州　510006）

瀕危植物七指蕨的孢子萌發(fā)和光合特性研究

宋莉英，李曉娜，潘曉婷

（廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510006）

七指蕨（Helminthostachys zeylanica）目前在我國僅零星分布于臺灣、海南和云南的西雙版納，其種群數(shù)量日趨減少，已被列為國家二級重點保護植物.本研究從七指蕨的孢子萌發(fā)特性和光合特性2方面入手，探討七指蕨可能的瀕危機制，為七指蕨的保護和資源利用提供科學(xué)依據(jù).結(jié)果顯示：①七指蕨孢子萌發(fā)率極低，是導(dǎo)致其自然更新較弱的原因之一；②七指蕨與瓶爾小草（Ophioglossum vulgatum）等其他蕨類植物相比，光補償點（LCP）接近，但七指蕨的光飽和點（LSP）和最大凈光合速率（Pmax）處于較低水平.這一結(jié)果說明，七指蕨屬于典型的陰生性植物，對光環(huán)境的適應(yīng)范圍較窄，強光下碳同化能力有限.森林植被的破壞導(dǎo)致光環(huán)境的改變，可能對七指蕨的生長、發(fā)育和繁殖造成巨大的威脅.因此，保護森林植被對于保護瀕危植物七指蕨至關(guān)重要.

瀕危植物；七指蕨；孢子萌發(fā)；光合特性

七指蕨（Helminthostachys zeylanica），屬七指蕨科（Helminthostachyaceae）七指蕨屬（Helminthostachys），別名入地蜈蚣，僅1屬1種［1］.分布于亞洲熱帶和大洋洲北部，我國產(chǎn)臺灣、海南和云南的西雙版納，生于濕潤疏蔭的林下.全株高30～55cm，根狀莖肉質(zhì)橫走，近頂部生有1～2片營養(yǎng)葉，掌狀或鳥足狀，孢子囊穗單生，通常高出營養(yǎng)葉.七指蕨具有較高的觀賞價值；同時，其根部含有豆甾醇、巖蕨甾醇、衛(wèi)矛醇、以及入地蜈蚣素等多種藥用成分，具有清肺化痰，散瘀解毒的作用，可用于治療咽痛、跌打腫痛、癰瘡、毒蛇咬傷等.受生境破壞及人為采挖的影響，目前七指蕨在我國的分布區(qū)狹窄，種群數(shù)量極為稀少.在1999年國家林業(yè)局、農(nóng)業(yè)部頒布的《國家重點保護野生植物名錄（第一批）》中，七指蕨被列為國家二級保護植物.

有關(guān)七指蕨的研究報道甚少.國內(nèi)學(xué)者焦瑜等［2］和李新國等［3］分別從葉表皮特征、孢子形態(tài)方面對七指蕨的系統(tǒng)分類學(xué)地位進行了探討，李艷平［4］從七指蕨中分離獲得了6種黃酮類物質(zhì).國外也有學(xué)者對七指蕨化學(xué)成分及藥用價值進行了報道［5－8］.迄今，還未見有關(guān)七指蕨的瀕危機理以及保護生物學(xué)研究方面的報道.

造成植物瀕危的原因是多方面的.其中，瀕危植物自身的一些生物學(xué)與生態(tài)學(xué)特性是導(dǎo)致其稀有瀕危的重要原因.大多數(shù)珍稀瀕危植物或多或少存在生殖障礙，或者在其生長的天然群落中受到其他植物的“排擠”，自我更新的能力較弱［9］.此外，對環(huán)境的生態(tài)適應(yīng)幅較窄也是一個重要的方面.光合作用是植物重要的生理過程，探討光合作用對環(huán)境因子的需求規(guī)律，尋求影響其光合作用的限制因子，可為進一步揭示種群瀕危機理提供科學(xué)依據(jù)［10］.

為此，本研究嘗試從七指蕨的孢子萌發(fā)特性以及光合特性2個方面，探討其可能的瀕危機制，為進一步加強對七指蕨的保護、種群的發(fā)展和資源的可持續(xù)利用提供科學(xué)依據(jù).

1　材料與方法

1.1植物材料

供試的七指蕨為中國科學(xué)院華南植物園繁育中心盆栽苗，引自海南五指山.瓶爾小草（Ophioglossum vulgatum），為瓶爾小草科（Ophiogiossaceae）多年生蕨類植物，與七指蕨同屬于瓶爾小草目（Ophioglossales）［1］.本研究中，選用瓶爾小草作為對照，探討七指蕨對光環(huán)境的適應(yīng)特點和光能利用能力.

1.2孢子萌發(fā)實驗

1.2.1孢子采集

將七指蕨成熟孢子葉穗從植株上剪下，置于干燥通風(fēng)處，待孢子自然散落后收集于硫酸紙袋中，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?

1.2.2消毒方法

孢子消毒參照杜紅紅等［11］的方法并做了部分修改.稱取5mg成熟孢子置于1.5mL離心管中，加入1mL蒸餾水浸泡2h，10 000rpm離心5min，棄去上清液；加入1mL 5％次氯酸鈉溶液，滅菌5min，然后用無菌水漂洗3～5次，最后加入1.5mL無菌水，充分振蕩獲得無菌的孢子懸濁液，分別接種于3個培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿0.5mL孢子懸浮液.

1.2.3培養(yǎng)條件

蕨類植物孢子萌發(fā)培養(yǎng)基一般采用MS為基本培養(yǎng)基，但有些種類在全培養(yǎng)基中不能萌發(fā)，只有在稀釋的MS等低鹽培養(yǎng)基中才能萌發(fā)［12］.因此，本研究中采用2種孢子萌發(fā)培養(yǎng)基：①1/10MS，②1/2MS，以上培養(yǎng)基均為30g·L－1蔗糖和0.7％瓊脂，pH 5.8.培養(yǎng)溫度為25℃，光照時間12h·d－1，光量子通量密度為20～30μmol·m－2·s－1.

1.3光合特性的測定

利用便攜式光合測定儀Licor-6400（Li-6400，Li-Cor，Lincoln，USA），于晴天上午8：00～11：30測定光響應(yīng)曲線.葉室光強由Licor-6400紅藍光源進行控制，葉面溫度控制在25℃，CO2濃度由小鋼瓶控制在400μmol· mol－1.葉片測定前，將待測葉片先在調(diào)整好環(huán)境條件的葉室中（光強為300μmol·m－2·s－1）適應(yīng)20min，再開始測定.測定時，依次設(shè)定光量子通量密度（photon flux density，PFD）為1 000，800、500、300、200、150、100、80、50、20、10和0μmol·m－2·s－1，每個光梯度下平衡3min后測定凈光合速率（Pn）.每個種測定6個植株，每株測定1個葉片.依據(jù)BASSMAN等［13］的方法擬合Pn-PFD曲線，計算最大凈光合速率（Pmax）、表觀量子效率（apparent quantum yield，AQY）、暗呼吸速率（Rd）、光飽和點（light saturation point，LSP）和光補償點（light compensation point，LCP）.

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS、Sigmaplot等軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和繪圖.所用數(shù)據(jù)顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，統(tǒng)計分析采用單因素方差分析.

2　結(jié)果與分析

2.1孢子萌發(fā)

經(jīng)30～40d的培養(yǎng)，培養(yǎng)基（1）、（2）中開始出現(xiàn)零星的綠色小點，顯微鏡檢驗結(jié)果為孢子萌發(fā).50～60d左右可見原葉體形成.其中，培養(yǎng)基（1）的萌發(fā)速度較快.七指蕨的原葉體在孢子萌發(fā)培養(yǎng)基上生長良好，隨著培養(yǎng)時間的延長，原葉體體積增大，簇生成團狀.但總的來說，無論在培養(yǎng)基（1）或（2）上，七指蕨的孢子萌發(fā)率均較低，平均每皿萌發(fā)1～2個.

2.2七指蕨與瓶爾小草光合特性的比較

由圖1A所示，光量子通量密度從0上升至100μmol·m－2·s－1時，七指蕨和瓶爾小草的凈光合速率隨著光強的增加呈直線式迅速上升.當(dāng)光量子通量密度從200上升至1 000μmol·m－2·s－1時，二者的凈光合速率逐漸達到飽和.通過曲線擬合可得，七指蕨達到其最大凈光合速率2.73μmol CO2·m－2·s－1時，光飽和點為272.32μmol·m－2·s－1，顯著低于瓶爾小草的最大凈光合速率和光飽和點（表1）.這一結(jié)果表明，七指蕨對強光的利用能力較弱，碳同化能力明顯低于瓶爾小草.從表1中還可見，七指蕨的表觀量子效率（0.05μmol·μmol－1）極顯著低于瓶爾小草（0.07μmol· μmol－1），說明它對弱光的利用率也較低，導(dǎo)致其在低光強下凈光合速率低于瓶爾小草.對比七指蕨和瓶爾小草的光補償點和暗呼吸速率，二者無明顯差異.

由圖1B可見，光量子通量密度為0μmol·m－2·s－1時，2種植物的胞間CO2濃度（Ci）為最高值，七指蕨為412.50μmol·mol－1，略高于瓶爾小草的395.13μmol·mol－1.七指蕨和瓶爾小草的胞間CO2濃度隨著光量子通量密度的升高而急劇降低，在光強為100μmol·m－2·s－1時，胞間CO2濃度降低速度趨于平緩.此時，瓶爾小草的胞間CO2濃度明顯高于七指蕨的胞間CO2濃度.

氣孔是植物與大氣進行氣體交換的通道，氣孔的閉合程度直接影響植物的光合與蒸騰過程.由圖1（C，D）可見，七指蕨和瓶爾小草氣孔導(dǎo)度（Gs）、蒸騰速率（Tr）對光量子通量密度的變化響應(yīng)曲線變化趨勢相同，表現(xiàn)為比較一致的緩慢上升趨勢，由此可以看出，植物的氣孔導(dǎo)度與蒸騰速率之間可能存在正相關(guān)關(guān)系.七指蕨的氣孔導(dǎo)度大約僅為瓶爾小草的1/4，其蒸騰速率大小也約為瓶爾小草的1/4.

3　討　論

3.1七指蕨的孢子萌發(fā)特性

蕨類植物是維管植物中較為原始的一個類群，具有獨特的生活史特征.蕨類植物屬于孢子植物，在野外一般通過孢子進行繁殖.本研究結(jié)果表明，七指蕨孢子萌發(fā)率極低，可能是導(dǎo)致其在自然條件下更新困難的原因之一.有文獻報道，添加外源赤霉素（GA3）對孢子萌發(fā)有促進作用［14］.本研究嘗試在孢子消毒前用50mg· L－1GA3處理5min，但未達到提高萌發(fā)率的效果.推測可能與GA3處理時間短、濃度低有關(guān).

圖1　七指蕨和瓶爾小草的光響應(yīng)曲線Fig.1　The light response curves of Helminthostachys zeylanica and Ophioglossum vulgatum

表1　七指蕨和瓶爾小草的光合特性比較Table 1　The photosynthetic characteristics comparison of Helminthostachys zeylanica and Ophioglossum vulgatum

3.2七指蕨的光合特性

各種植物對光的需求量（即對光量子通量密度的適應(yīng)范圍）是不同的.通過擬合光響應(yīng)曲線計算出植物的光合特性參數(shù)，可以反映植物對不同光環(huán)境的適應(yīng)性狀況.本研究結(jié)果表明，七指蕨與瓶爾小草的光補償點相似，均表現(xiàn)出較低的水平，符合陰生植物的特點.但七指蕨的光飽和點顯著低于瓶爾小草，表明七指蕨對光環(huán)境的適應(yīng)范圍較窄，對強光的利用能力有限.因此，其最大凈光合速率也表現(xiàn)出顯著低于瓶爾小草.

表2比較了七指蕨與國內(nèi)其他蕨類植物光合特性參數(shù).表2中可見，七指蕨與其他蕨類的光補償點（LCP）和表觀量子效率（AQY）差異不大；而其光飽和點（LSP）和最大凈光合速率（Pmax）則處于較低水平.

3.3七指蕨的瀕危機制及保護對策

從本研究結(jié)果來看，造成七指蕨瀕危的原因可能有2個方面，一方面是孢子萌發(fā)率低，自我更新能力弱；另一方面，七指蕨對光環(huán)境的適應(yīng)幅較窄.由于人類進行土地開發(fā)的強度和范圍不斷擴大，森林資源被大量砍伐，不僅導(dǎo)致森林和土壤的水分涵養(yǎng)能力降低，更重要的是破壞了原有森林蔭蔽的光環(huán)境.七指蕨通常生長在蔭蔽潮濕條件下，對環(huán)境條件的改變極為敏感，一旦森林植被遭受破壞，七指蕨直接暴露于強光下，強光的直射及生境的干旱化會對其生長、發(fā)育和繁殖造成巨大的威脅.與此同時，七指蕨的光合能力較弱，與其他蕨類等陰生植物相比，在生長競爭過程中處于劣勢，從而導(dǎo)致其種群數(shù)量大幅下降.

基于上述研究，要保護七指蕨種群，促使其野生資源的再生，首先應(yīng)從保護七指蕨賴以生存的生態(tài)環(huán)境做起，減少亂砍亂伐，增加森林覆蓋率，營造適合七指蕨生存生長發(fā)育的蔭蔽條件.其次，蕨類植物孢子萌發(fā)受多種因素影響［19］，可以從光照、溫度、基本培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑等方面進一步篩選有利于七指蕨孢子萌發(fā)的培養(yǎng)條件，利用組織培養(yǎng)等生物技術(shù)擴大種群數(shù)量，對于實現(xiàn)七指蕨種群復(fù)壯也具有重要意義.

表2　七指蕨與其他蕨類植物的光合特性比較Table 2　The photosynthetic characteristics comparison of Helminthostachys zeylanica and other pteriodphytes

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Study on endangermentmechanism s of the rare plant Helminthostachys zeylanica

SONG Li-ying，LIXiao-na，PAN Xiao-ting

（School of Life Sciences，Guangzhou University，Guangzhou 510006，China）

Helminthostachys zeylanica，a rare and endangered plant，has a scattered distribution only in Taiwan，Hainan and Yunnan provinces.Itwas listed as a plantof second-class protection in The Listof Chinese Urgently Protected Wild Plants.To explore the possibly endangermentmechanisms of H.zeylanica，spore germination rate and photosynthetic characteristicswere investigated in this study.The results were as follows：①The spore germination rate of H.zeylanica was quite lower，which results in a relatively weak natural regeneration.②Compared with Ophioglossum vulgatum and other pteriodphytes，Helminthostachys zeylanicas showed a similar light compensation point（LCP）to them，but lower light saturation point（LSP）and themaximum net photosynthetic rate（Pmax）.It suggested that H.zeylanica was a representative shade plantwith a narrow light adaption scope and low carbon assimilation under high light.The destruction of forest vegetation led to changes in light environment，which caused a huge threat to the growth and reproduction of H.zeylanica.Therefore，the protection of forest ecological environment is essential to protect the endangered plant H.zeylanica.

endangered plant；Helminthostachys zeylanica；spore germination；photosynthetic characteristics

1671-4229（2015）06-0031-05

Q 94

A

2015－03－12；

2015－04－06

廣東省高等學(xué)校優(yōu)秀青年教師培養(yǎng)計劃資助項目（Yq2013132）；廣州大學(xué)引進人才科研啟動資助項目.

宋莉英（1978－），女，副研究員，博士.E-mail：liying_song＠126.com

【責(zé)任編輯：周全】