正交試驗(yàn)優(yōu)化水煎提取苜蓿棗芪總黃酮工藝

鄧發(fā)星 祝芙蓉 李坤江 付美華 田晨欣(西北民族大學(xué)化工學(xué)院， 甘肅 蘭州 7000)

紫花苜蓿(Medicago sativa)是一種高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的多年生豆科牧草,在世界許多國家廣泛栽培,也是我國推廣應(yīng)用的主要牧草[1]。紫苜蓿含有大豆黃酮、皂苷、苜蓿酚、苜蓿素、瓜氨酸、糖等。紫花苜蓿具有品質(zhì)好、產(chǎn)草量高、適口性好、營養(yǎng)豐富、易于家畜消化等特點(diǎn),故有“牧草之王”美譽(yù)[2]。大棗(zizyphus jujuba dates)含有三帖酸、黃酮、環(huán)磷酸腺苷等。大棗既是普通食品，也是常用的藥品，久食或入藥膳，有補(bǔ)氣血，益脾胃，通九竅，潤膚養(yǎng)顏，延年養(yǎng)生之保健功效[3]。黃芪(Radix Astragali)是百姓經(jīng)常食用的純天然品，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，黃芪有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、保肝、利尿、抗衰老、抗應(yīng)激、降壓和較廣泛的抗菌作用，能增強(qiáng)心肌收縮力，調(diào)節(jié)血糖含量，提高免疫功能，能夠延緩細(xì)胞衰老的進(jìn)程。

探究苜蓿、大棗、黃芪三種藥食兩用材料中的活性物質(zhì)含量對制備保健食品有一定幫助，有望改善亞健康、提高身體免疫力。總黃酮在三種材料中是具有代表性的活性物質(zhì)，所以探究苜蓿棗芪中總黃酮提取工藝是有意義的。

1 材料與儀器

1.1 材料

中性濾紙(型號102中速，杭州特種紙業(yè)有限公司)，95%乙醇(分析純)，聚酰胺100目(層析柱用)，殼聚糖(醫(yī)藥級)，飲用水，苜蓿(采于西北民族大學(xué)化工學(xué)院)，黃芪(蘭州復(fù)興厚藥材有限責(zé)任公司第一藥莊)，大棗(蘭州隆興商貿(mào)有限公司)。

1.2 儀器

控溫水浴鍋(南通滬南科學(xué)儀器有限公司)，DHG—9245A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海—恒科學(xué)儀器有限公司)，干燥器，層析柱(泓宇儀器)，電子分析天平。

2 實(shí)驗(yàn)步驟與結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)前處理

稱取苜蓿約7g，黃芪約9g，大棗約6g，精密稱定。苜蓿截段，黃芪截段，大棗在150℃,45min進(jìn)行干燥，大棗截段。

2.1.1 溶脹系數(shù)的測定

將三者混合物置于500ml圓底燒瓶中，量取200ml飲用水于圓底燒瓶中，冷浸24h,過濾，得濾液112.8ml，算得混合物共吸水87.2ml，即其溶脹系數(shù)為0.436。

2.1.2 水煎

將三者混合物置于500ml圓底燒瓶中，吸取適量飲用水置于圓底燒瓶中，冷浸45min，備用。

取備用物在一定條件下水煎。水煎后，冷卻至室溫，補(bǔ)齊其損失水分，將其過濾，備用。

2.1.3 聚酰胺實(shí)驗(yàn)中乙醇洗脫總黃酮用量選擇

取備用原料在80℃、60min及料液比為1:6條件下水煎。分別設(shè)置三組實(shí)驗(yàn)，各加入40ml、45ml、50ml乙醇洗脫黃酮，經(jīng)干燥失重法測得黃酮量依次為10mg、10.3mg、10.02mg。三者平均值為10.17mg,經(jīng)計(jì)算RSD=1.5%,小于2%。即選取乙醇用量為40ml。

2.1.4 聚酰胺吸附實(shí)驗(yàn)

用量筒量取30ml濾液,加入約75mg殼聚糖，殼聚糖用于中藥水提液的澄清主要與其吸附性能和絮凝作用有關(guān)[4]，微微加熱使濾液中蛋白質(zhì)充分沉淀，冷卻至室溫，補(bǔ)齊其損失水分，過濾，稱量約0.3g聚酰胺上柱，量取適量乙醇過柱洗脫聚酰胺中醇溶性雜質(zhì)，用量筒量取沉淀蛋白后的溶液10ml裝柱，進(jìn)行聚酰胺吸附黃酮實(shí)驗(yàn)，聚酰胺具有吸附黃酮的特性[5]，量取95%乙醇40ml洗脫總黃酮。

理論 · 實(shí)踐2.1.5 干燥失重法測定總黃酮量及固化物量

使坩堝在105℃干燥至恒重，得重量m1。將洗脫的總黃酮置于坩堝中，用水蒸汽加熱至乙醇完全揮發(fā)，坩堝放入烘箱105℃干燥，30min后取出置干燥器中放冷，然后稱定重量，至恒重，得重量m2，即總黃酮量計(jì)算式為m2-m1。

固化物量測定依照黃酮量測定進(jìn)行。

2.2 提取條件的選擇

2.2.1 溫度的選擇

圖1 溫度對總黃酮提取量的影響

取備用混合物在60min、料液比為1∶7及溫度分別為70℃、80℃、90℃條件下水煎。通過聚酰胺吸附實(shí)驗(yàn)得到70℃條件下黃酮量為72.65mg,80℃條件下黃酮量為133.47mg,90℃條件下黃酮量為115.53mg,如圖1所示。由圖1可得：總黃酮提取的最佳溫度為80℃。

2.2.2 料液比的選擇

取備用混合物在60min、80℃及料液比分別為1∶6、1∶7、1∶8條件下水煎。通過聚酰胺吸附實(shí)驗(yàn)得到1∶6條件下黃酮量為98.34mg,1∶7條件下黃酮量為133.47mg,1∶8條件下黃酮量為130.11mg,如圖2所示。

圖2 料液比對黃酮提取量的影響

由圖2可得：總黃酮提取的最佳料液比為1∶7。

2.2.3 浸提時(shí)間和次數(shù)的選擇

取備用混合物在料液比為1∶7、80℃及浸提時(shí)間分別為30min、60min、90min、120min條件下水煎。通過聚酰胺吸附實(shí)驗(yàn)得到30min條件下一煎黃酮量為86.45mg,二煎黃酮量為35.36mg；60min條件下一煎黃酮量為133.47mg,二煎黃酮量為91.25mg；90min條件下一煎黃酮量為129.32mg,二煎黃酮量為85.31mg；120min條件下一煎黃酮量為124.37mg,二煎黃酮量為82.57mg；如圖3所示。

圖3 浸提時(shí)間和次數(shù)對黃酮提取量的影響

由圖3可得：總黃酮最佳的浸提時(shí)間為60min，由于二煎提取的總黃酮量趨勢變化較一煎明顯，即最佳浸提次數(shù)為2次。

2.3 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理

通過單因素試驗(yàn)的分析，選取各因素中最佳條件附近試驗(yàn)點(diǎn)作為正交試驗(yàn)點(diǎn)，對各個(gè)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行誤差分析，確定最佳提取黃酮工藝方案。本試驗(yàn)采用L9(34)正交表，以溫度(A)、浸提時(shí)間(B)、料液比(C)作為三個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)計(jì)三個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)。

表1 水煎法提取黃酮正交試驗(yàn)因素與水平

針對表1所設(shè)計(jì)的正交試驗(yàn)因素與水平進(jìn)行一煎提取試驗(yàn)，總黃酮提取結(jié)果見表2，總黃酮提取結(jié)果方差分析見表3，固化物結(jié)果見表4，固化物方差分析見表5。

表2 總黃酮提取結(jié)果

由表2極差結(jié)果分析得到，RC>RA>RB。三個(gè)因素對苜蓿棗芪中總黃酮提取的影響程度為：料液比(C)>溫度(A)>浸提時(shí)間(B)。

表3 總黃酮提取結(jié)果方差分析

表3分析得到，試驗(yàn)所測得的F值均大于F0.05(2,2)=19.00，所以料液比、溫度及浸提時(shí)間均具有顯著性，在正交試驗(yàn)范圍內(nèi)，優(yōu)化水煎苜蓿棗芪中總黃酮提取工藝為A3B3C3，即料液比為1∶7.5，溫度85℃，浸提時(shí)間為75min。

通過對固化物結(jié)果極差分析得到，RC>RA>RB。三個(gè)因素對苜蓿棗芪中總黃酮提取的影響程度為：料液比(C)>溫度(A)>浸提時(shí)間(B)。同時(shí)從固化物結(jié)果方差分析中得到，料液比(C)及溫度(A)均具有顯著性，與表3分析結(jié)果一致，證實(shí)總黃酮提取最佳工藝為A3B3C3是合理的。

表4 固化物結(jié)果

表5 固化物結(jié)果方差分析

2.4 正交最佳試驗(yàn)驗(yàn)證

在總黃酮提取最佳工藝為A3B3C3條件下進(jìn)行3組平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表6所示。

表6 A3B3C3條件下一煎結(jié)果

由表6得：苜蓿大棗黃芪三種原料平均量為22.02mg，一煎總黃酮平均量為197.12mg及其收率為0.90%，一煎固化物量為3881.32mg及其收率為17.63%。

2.5 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)選定水煎浸提次數(shù)為2次，由正交驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中各數(shù)據(jù)進(jìn)行二煎后結(jié)果如表7所示。

表7 A3B3C3條件下二煎結(jié)果

結(jié)合A3B3C3條件下在煎煮2次后，所得到3組苜蓿棗黃芪平均量為22.02g，總黃酮平均量為283.10mg及其收率為1.29%；固化物平均量為6521.45mg及其收率為29.62%。

3 結(jié)語

(1)本實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)法選取苜蓿棗芪中總黃酮最佳提取工藝條件：溫度為85℃、料液比為1∶7.5、浸提時(shí)間為75min、浸提次數(shù)為2次，得到總黃酮收率為1.29%，固化物收率為29.62%。

(2)水煎法是中藥傳統(tǒng)提取方法，結(jié)合單因素試驗(yàn)法和正交試驗(yàn)法探究影響總黃酮提取的因素，采用聚酰胺吸附法和重量法測定總黃酮量。方法簡單易行。

(3)試驗(yàn)中采用殼聚糖作為絮凝劑，除去提取液中的蛋白質(zhì)及鞣質(zhì)等雜質(zhì)。殼聚糖以其成本低，具有良好的生物學(xué)可溶性，又能保留有效成分等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于中藥藥液的精制[6]。

(4)重量法要求對實(shí)驗(yàn)者有較高操作能力，由此也會(huì)造成一定誤差。

[1,2]朱見明，李娜，張亞軍,等.苜蓿黃酮的研究進(jìn)展[J].草業(yè)科學(xué)，2009,26(9)：156.

[3]王蓉珍，趙子青，林勤保,等.大棗功效成分檢測的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2012,33(4)：423.

[4]張彤，徐連英，蔡貞貞.殼聚糖澄清劑精制中藥水提液的應(yīng)用前景[J].中國中藥雜志，2001,26(8)：517.

[5]張中建，閻小偉.聚酰胺吸附法測定總黃酮[J].分析檢測，2002,23(10)：81.

[6]孫星，盛華剛，張超，等.殼聚糖絮凝沉降法對葛根芩連湯中黃酮和生物堿成分的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012,18(20)：15.