用星點設計-效應面法優化錐栗總黃酮超聲提取工藝

朱 思，牛廣俊，蘇素嬌，李 娜，陳詩強，陳 亮，梁一池

（福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122）

用星點設計-效應面法優化錐栗總黃酮超聲提取工藝

朱 思，牛廣俊，蘇素嬌，李 娜，陳詩強，陳 亮，梁一池

（福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122）

為了優選錐栗中總黃酮的超聲提取工藝條件，以乙醇體積分數、提取時間、液固比為試驗因素，以錐栗總黃酮的提取率為考察指標，在單因素試驗的基礎上，采用星點設計-效應面法（CCD-RSM），對錐栗總黃酮的提取工藝條件進行了優化試驗。結果表明，錐栗總黃酮的最佳提取工藝條件為：80%乙醇，超聲提取20 min，固液比為24，提取溫度為50 ℃。按此工藝提取，總黃酮的提取率為0.0685%；且此方法操作簡便，結果穩定，預測性良好。

錐栗；星點設計-效應面法；總黃酮；超聲提取

錐栗Castanea henryi為殼斗科栗屬植物，又名珍珠栗，尖栗等[1]，主要分布于閩北及浙南山區等地。唐朝孫思邈的《千金要方》中云：“栗子，味咸溫無毒，益氣厚腸胃，補腎氣，令人耐肌，生食之，甚治腰腳不遂。”《本草綱目》中記載：栗，腎之果也，栗能通腎，益氣溫胃，久食必強健。錐栗中所含的黃酮類化合物具有良好的抗氧化[2]、降脂、抗心律失常等功用[3]。為了優選錐栗中總黃酮的超聲提取工藝條件，利用紫外-可見分光光度法，采用星點設計-效應面法，對錐栗中總黃酮的提取工藝條件進行了優化試驗，CCDRSM可以克服均勻設計和正交設計試驗結果不夠精確、數學模型預測性較差的弱點，可以獲得更高的提取率。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

供試錐栗為建甌‘八月香’品種，經福建中醫藥大學藥學院梁一池教授鑒定，其為殼斗科栗屬錐栗的成熟種子。將錐栗去殼及種皮，種仁于40 ℃下干燥至恒重，粉碎，過40目篩，置于干燥器中以備用。

UV-9100紫外可見分光光度計，北京瑞利分析儀器公司；TDL80-2B臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；THC-10B數控超聲波提取器，濟寧天華超聲電子儀器有限公司；AR2130電子天平，上海奧豪斯儀器有限公司；蘆丁對照品，成都曼思特生物科技有限公司，純度≥98%，批號為MUST-12040302。水為蒸餾水，其他試劑均為分析純。

1.2 方 法

對照品溶液的制備：精密稱取蘆丁對照品4 mg，置于10 mL的量瓶中，加入70%乙醇溶解，并定容至刻度，搖勻，然后置于冰箱中冷藏以備用。

供試品溶液的制備：精密稱取錐栗粉末約1 g，置于100 mL的錐形瓶中，量取60%乙醇10 mL，稱定重量，浸泡30 min后，于50 ℃下超聲提取30 min，放至室溫后稱重，補足失重，離心，取上清液，即得。

最大吸收波長的確定[4]：精密量取上述蘆丁對照品溶液1 mL，置于10 mL的量瓶中，加入70%乙醇2.4 mL，加入5%的亞硝酸鈉溶液0.4 mL，搖勻，放置6 min后，加入10%的硝酸鋁溶液0.4 mL，搖勻，放置6 min后，再加入4%的氫氧化鈉4 mL，加入70%的乙醇至刻度，搖勻，放置15 min后，以相應試劑為空白，于200～800 nm處掃描，結果發現，在510 nm處有最大吸收量，因而確定510 nm為測定的波長。

標準曲線的繪制[5]：分別移取2.1所述對照品溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL 于8個10 mL的量瓶中，加入70%的乙醇2.4 mL，加入5%亞硝酸鈉溶液0.4 mL，搖勻，放置6 min后加入10%硝酸鋁溶液0.4 mL，搖勻，放置6 min后加入4%氫氧化鈉4 mL，加入70%乙醇至刻度，搖勻，15 min后于510 nm波長處比色測定，以相應試劑為空白，以對照品濃度X（mg·mL－1）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，得到如下線性回歸方程：

A＝11.659X＋0.0106（r＝0.9993，線性范圍為0.008～0.064 mg·mL－1）。

星點設計試驗：在單因素試驗的基礎上，采用星點設計試驗[6]，以對總黃酮提取率影響較顯著的乙醇體積分數（X1）、提取時間（X2）、固液比（X3）為自變量，以錐栗總黃酮提取率為因變量[7]。考慮到提取次數為非連續變量，結合生產實際，暫定為1次。試驗因素與水平見表1。

表 1 錐栗中總黃酮超聲提取工藝星點設計因素與水平Table 1 Factors and levels of the central composite design test of total flavonoids extraction in C. henryi nuts

2 結果與分析

2.1 方法學考察結果

精密度試驗結果：連續6次測定同一對照品溶液，其吸光度的平均值為0.401，相對標準偏差RSD為0.417%，說明測定方法的精密度良好。

穩定性試驗結果：取供試品溶液1份，顯色15 min后，每隔5 min測定吸光度，在30 min的測定時間內，吸光度的平均值為0.391，相對標準偏差RSD為2.49%，表明供試品溶液在30 min內顯色穩定。

重復性試驗結果：取錐栗粉末6份，按照1.2中的“供試品溶液的制備”及“最大吸收波長的確定”方法進行處理，于510 nm處測定吸光度并計算總黃酮提取率，總黃酮平均提取率為0.046%，相對標準偏差RSD為2.74%，表明方法的重復性良好。

加樣回收率試驗結果：取已知含量的錐栗粉末6份，每份約0.5 g，精密稱定，分別置于錐形瓶中，各加入蘆丁對照品溶液（0.243 mg·mL－1）1 mL，按1.2中的“供試品溶液的制備”及“最大吸收波長的確定”方法處理，于510 nm處測定吸光度，計算加樣回收率，結果見表2，相對標準偏差RSD為1.98%，表明提取方法回收率良好。

2.2 試驗數據的統計與分析

取錐栗粉末約1 g，精密稱定，按表3中的試驗號進行提取，按照上述測定方法測定錐栗中總黃酮的含量，結果見表3。

表 2 總黃酮加樣回收試驗結果Table 2 Result of total flavonoids recovery test

表 3 星點試驗設計方案與試驗結果Table 3 Scheme and result of the central composite design test

應用Design Expert 8.0.6軟件對星點設計試驗獲得的數據進行多元回歸與方差分析，對各試驗因素進行多元線性回歸和二項式擬合[8]。

多元線性回歸方程為：

Y＝ 1.34×10－2＋ 5.68×10－4X1－ 3.549×10－5X2＋ 2.894 95×10－4X3，r＝ 0.849 0。

二項式擬合方程為：

Y=－ 3.79×10－4＋ 3.47×10－4X1＋ 5.56×10－4X2＋ 9.96×10－4X3－ 3.55×10－6X1X2－ 1.17×10－5X1X3－ 1.43×10－5X2X3＋ 4.72×10－6X12－1.67×10－6X22＋ 1.98×10－5X3

2，r=0.946 7。分析上述方程可知，多元線性回歸方程的相關系數較低（r＝0.849 0），表明自變量和因變量之間的線性關系較差，擬合優度不佳，預測性不及二項式擬合的結果，因此該數學模型不合適，宜采用二項式擬合，結果見表4。

表 4 回歸模型分析結果?Table 4 Analysis result of regression models

由表4中的P值可知，其中一次項X1為極顯著，X3和交互項X2X3為顯著水平，二次項和其他項均為不顯著。模型為極顯著水平，失擬項P＞0.05，表明模型因噪音干擾所致的機率較小，二項式擬合模型為成功擬合模型。

2.3 工藝參數的優化結果

根據擬合的二次多項式方程，繪制總黃酮提取率隨各因素的影響而變化的效應面圖，結果如圖1～3所示。總黃酮提取率最大值為0.0685%，最佳提取工藝條件為：乙醇體積分數為80%，提取時間為20 min，固液比為24。

圖 1 乙醇體積分數和提取時間對總黃酮提取率的影響效應面圖Fig. 1 Response surface curve to effect of ethanol volume fraction and extraction time on extraction rate of total fl avonoids

圖 2 乙醇體積分數和固液比對總黃酮提取率的影響效應面圖Fig. 2 Response surface curve to effect of ethanol volume fraction and solid-liquid ratio on extraction rate of total fl avonoids

圖 3 提取時間和固液比對總黃酮提取率的影響效應面圖Fig. 3 Response surface curve to effect of extraction time and solid-liquid ratio on extraction rate of total fl avonoids

2.4 驗證試驗結果

根據最佳工藝條件提取并測定錐栗中總黃酮的含量，3組平行試驗的平均提取率為0.0673%，相對標準偏差RSD為1.15%，實際值與預測值間的偏差率為－1.08%，這表明采用優化得到的工藝條件進行提取，可以獲得較高的總黃酮提取率。

3 討 論

憑借較好的試驗精度和可分析的各個因素之間的相互作用，星點設計-效應面法在藥學領域的運用越來越廣泛，采用這種方法的試驗次數比正交設計法有所減少，這樣既節省了時間又節約了資源[9]。本試驗因總黃酮提取率隨乙醇體積分數的增加而持續增加，故效應面的曲面弧度較小，因而在實驗中選取對因變量影響較顯著的因素，效應面弧度將變大。

錐栗為藥食兩用的佳品，目前國內外對其生理生化、良種繁育[10]、生態、栽培[11]、病蟲害、加工等方面的研究報道較多[12]，而對其保健方面的研究報道卻較少。本試驗對其總黃酮的提取工藝進行探討，旨在為錐栗的進一步開發利用提供依據。

[1]楊利民.植物資源學[M].北京：中國農業出版社,2008：173.

[2]鄭誠樂,許偉東,潘東明,等.正交試驗法測定錐栗總黃酮含量技術研究[J].中國農學通報,2009,25(1)：128－131.

[3]李姣娟,戴 瑜.川桂葉總黃酮對油脂抗氧化作用的研究[J].中南林業科技大學學報,2011,31(10)：134－137.

[4]謝 臻,陳 勇,曾海生,等.星點設計-響應面法優選地桃花中總黃酮的提取工藝[J].中國實驗方劑學雜志,2011,17(12)：27－30.

[5]王婧杰,馬鳳鳴,穆立薔.用響應面法優化超聲波輔助提取紫椴枝皮中的黃酮[J].經濟林研究,2012,30(4)：113－118.

[6]喻林華,方 晰.正交試驗優選薄荷總黃酮超聲提取工藝研究[J].中南林業科技大學學報,2012,32(8)：94－97.

[7]梁 雪,楊越冬.用加壓溶劑萃取法提取板栗多糖的工藝條件[J].經濟林研究,2013,31(3)：98－102.

[8]劉常青,謝友良,賴小平.星點設計-效應面法優選青天葵總黃酮提取工藝[J].中國實驗方劑學雜志,2012,18(12)：24－27.

[9]劉艷杰,項榮武.星點設計效應面法在藥學試驗設計中的應用[J].中國現代應用藥學,2007,24(6)：455－457.

[10]梁一池.錐栗數量性狀遺傳參數分析[J].經濟林研究,1995,13(3)： 25 － 28.

[11]梁一池.錐栗無性系多性狀綜合選擇的研究[J].中南林學院學報 ,1996,16(1)：50 － 55.

[12]馮金玲,楊志堅,陳 輝.錐栗的研究進展[J].亞熱帶農業研究 ,2009,5(4)：237 － 241.

Optimization of total fl avonoids extraction process inCastanea henryinuts by central composite design and response surface method

ZHU Si, NIU Guang-jun, SU Su-jiao, LI Na, CHEN Shi-qiang, CHEN Liang, LIANG Yi-chi
(College of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian, China)

To optimize extraction process of total flavoniods inCastanea henryinut, taking ethanol volume fraction,extraction time and liquid-solid ratio as factors, and extraction rate of total flavoniods as a selection index, based on results of single factor tests, extraction process of total fl avoniods inC. henryinut was optimized by central composite design and response surface method. The results showed that the optimum conditions were extracting for 20 min at 50 ℃with 80% ethanol, solid-liquid ratio was 24, and extraction rate of total fl avoniods was 0.0685%. The method was simple and stable, and had good predictability.

Castanea henryi; central composite design and response surface method; total flavonoids; supersonic extraction

S609.9；S792.17 文獻標志碼：A 文章編號：1003—8981(2015)01—0127—04

2014-03-09

福建省第四期林木種苗重點攻關項目“錐栗優良種質評選與應用研究”（閩林科〔2013〕1號）。

朱 思，碩士研究生。

梁一池，教授。E-mail：fafulyc@126.com

朱 思,牛廣俊,蘇素嬌,等.用星點設計-效應面法優化錐栗總黃酮超聲提取工藝[J].經濟林研究,2015,33(1)：127－130.

[本文編校：伍敏濤]