維甲酸X受體在雜色鮑性腺發育中的調控作用研究

王鑫，王淑紅(集美大學水產學院，福建廈門361021)

性別決定與性腺發育一直都是現代生物學研究的重要領域之一，它們是彼此緊密聯系的2個過程:性別決定首先確定了個體性腺發育的方向，性腺發育在性腺分化的基礎上，經過遺傳、環境、生理等因素復雜的相互作用，最終發育成成熟的精巢和卵巢［1］。性別決定與性腺發育的作用機制可以歸納成2種類型:一類為遺傳決定系統(Genetic sex-determination system，GSD)，即由遺傳因素決定性別，主要指性染色體和性別決定基因的調控;另一類為環境決定系統(Environmental sex-determination system，ESD)，即周圍環境因子的調控，主要是性激素、環境因子等外部因素的作用。軟體動物性別決定與性腺發育的分子機制尚未明確，該過程相關的基因也尚未得到證實［2－6］，加上絕大多數軟體動物尚未發現性染色體和性別決定基因，因此軟體動物性腺發育的作用分子機制可能是環境決定系統。

在20世紀，研究人員已經發現性激素包括雌二醇、睪酮和孕酮廣泛存在于腹足類［6－8］和雙殼類［9－10］等軟體動物中。Osada等［11］和Li等［12］研究發現在雙殼類生物體內注射雌二醇能促進卵黃的生成并調節排卵過程。Varaksina等［13］報道在蝦夷扇貝(Mizuhopecten yessoensis)體內注射雌二醇、睪酮和孕酮后能刺激成體樣品的卵子發生和精子發生，導致卵母細胞直徑的增長以及性腺重量的增加。但是，Scott［3－4］綜述了200多篇主張軟體動物存在脊椎動物類型類固醇激素觀點的學術論文，指出目前沒有確切證據表明軟體動物能夠合成脊椎動物類型的類固醇激素。因此，盡管軟體動物體內存在類似于脊椎動物的雌激素和雄激素，但由于缺乏對其生物合成途徑或來源的了解以及有關激素受體的直接證據，脊椎動物類型的類固醇激素在軟體動物性腺分化中的作用仍是一個未解之謎。

維甲酸X受體是核受體家族重要的組成成員，其主要功能是作為轉錄因子來參與生物發育、細胞分化、新陳代謝以及細胞凋亡過程。RXR還是孤兒受體家族的一員，目前還沒有找到RXR的天然配體。軟體動物RXR基因的相關研究已經越來越受到重視。2004年，Nishikawa等［14］研究發現TBT與TPT能改變人RXR的表達水平;Castro等［15］在對狗巖螺的試驗中發現性畸變的誘導是由RXR信號途徑調控的。2011年，Horiguchi等［16］向疣荔枝螺注射了9cRA，通過實時熒光定量PCR技術檢測發現TcRXR的mRNA水平在性畸變個體的陰莖和輸精管顯著上升，這說明RXR參與了有機錫致疣荔枝螺性畸變的過程。這表明RXR基因確實參與了TBT等有機錫化合物調控軟體動物性腺發育的過程。

雜色鮑(Haliotis diversicolor)，屬于腹足綱(Gastropoda)、前鰓亞綱(Prosobranchia)、原始腹足目(Archaeogastropoda)、鮑科(Haliotidae)、鮑屬(Haliotis)，是我國南方重要經濟貝類之一，闡明雜色鮑性腺發育的分子機制對于雜色鮑的健康養殖有著重要的意義。筆者以雜色鮑為研究對象，采用實時定量PCR技術研究RXR基因在雜色鮑性腺發育不同階段的表達情況，確認雜色鮑性腺分化的關鍵窗口期。然后，采用RNA干擾技術，在雜色鮑性腺分化的關鍵時期沉默RXR基因、RXR基因以及細胞凋亡相關基因在雜色鮑性腺分化與發育中的作用。

1 材料與方法

1．1 試驗動物 試驗用雜色鮑購自于廈門市翔安區培陽水產養殖公司并放養在培陽水產養殖公司，每天都由養殖公司工作人員喂養新鮮江蘺(Gracilaria verrucosa)，海水溫度控制在25℃左右。每月解剖樣本時挑選重量一致、附著力強的健康鮑魚。解剖鮑魚時，分別采集頭部組織、肝胰腺組織以及性腺組織，液氮速凍后置于－80℃冰箱保存備用。

1．2 dsRNA的合成 以Trizol法提取雜色鮑總RNA并通過反轉錄得到的線性化cDNA為模板，通過PCR技術擴增了雜色鮑RXR基因的干擾片段，然后通過目的基因與質粒載體連接、感受態細胞的轉化和篩選、質粒插入片段的檢測、質粒測序等步驟制備得到合成dsRNA所需的線性化DNA。采用體外轉錄法合成dsRNA。0．5 ml PCR管加入以下反應體系:1 μg 線性化的 DNA、20 μl 10 × 轉錄緩沖液、10 μl 10 mmol/L ATP、10 μl 10 mmol/L CTP、10 μl 10 mmol/L GTP、10 μl 10 mmol/L UTP、1 μl RNase inhibitor、2 μl RNA polymerase、5 μl 0．1 mol/L DTT，加入 DEPC 水至 100 μl。試驗完成后，取少量樣品用1．2%瓊脂糖凝膠電泳檢測dsRNA的質量，同時用紫外分光光度計檢測dsRNA的濃度。剩余的樣品加入1 μl RNase inhibitor，－80℃下保存備用。

1．3 RNA干擾試驗 將暫養7 d的雜色鮑分成3組:第1組在鮑魚肝胰腺的中間部位注射1．5 μg/b．w．的滅菌海水;第2組在鮑魚肝胰腺的中間部位注射1．5 μg/b．w．的dsRNA-EGFP;鮑魚肝胰腺的中間部位注射 1．5 μg/b．w．的 dsRNA-RXR。注射完成后將鮑魚放回之前的缸中放養。48 h后解剖鮑魚進行RNA提取。

1．4 實時定量PCR試驗 實時定量熒光PCR反應體系(10 μl):SYBR Green PCR Master Mix 5 μl、上游引物 F 0．5 μl、下游引物 R 0．5 μl、cDNA 模板 4 μl。

實時定量熒光PCR反應程序:95℃預熱5 min;95℃變性15 s，60℃退火1 min，40個循環;最后，進行溶解曲線分析:95℃ 5 s，65℃ 1 min，從65℃升溫至97℃(每10 s上升0．11 ℃)。

定量的結果采用 LightCycler?480Software1．5分析，運用Pfaff法(RQ=(1+E)△Cq，△Cq=最小的Cq值分別減去各組織樣本的Cq值，E為不同基因引物的擴增效率)，并使用SPSS19．0統計軟件進行單因素方差分析，用RQ值表示基因的表達水平。

2 結果與分析

2．1 雜色鮑卵巢發育過程中RXR的表達變化 根據前期對雜色鮑性腺石蠟切片的顯微鏡觀察結果(性腺的顏色、體積、生殖細胞的形態結構及占主體的生殖細胞的類型等)，將雜色鮑的性腺發育周期分為4個時期:休止期、增殖期、生長期、成熟期。根據前期對雜色鮑卵巢內參基因的篩選，將OAZ1作為卵巢內基因相對表達的最適內參。

從圖1可以看出，在卵巢組織中RXR基因在性腺發育增殖期和生長期的表達量顯著上調(P＜0．05);此后，在性腺發育成熟期和休止期的表達量顯著下調。在雌性雜色鮑頭部組織中，RXR基因在性腺發育的增殖期表達量顯著上調(P＜0．05);在性腺發育生長期、成熟期和休止期表達量顯著下調。在雌性雜色鮑肝胰腺組織，RXR在性腺發育的增殖期時表達量顯著上調(P＜0．05);在性腺發育生長期、成熟期和休止期時表達量顯著下調。在雄性雜色鮑頭部組織，RXR基因在性腺發育的增殖期時表達量顯著上調(P＜0．05);在性腺發育生長期、成熟期和休止期時表達量顯著下調。在雄性雜色鮑肝胰腺組織中，RXR基因在性腺發育生長期的表達量顯著上調(P＜0．05);在性腺發育成熟期時表達量顯著下調表達;在性腺發育休止期時表達量呈上升趨勢;在性腺發育增殖期，表達量顯著下調。

2．2 RXR基因的RNA干擾結果 為了檢測RXR基因沉默對雌性雜色鮑RXR基因的表達的影響，利用熒光定量PCR技術分析RXR基因沉默后樣品中RXR基因的mRNA表達水平。從圖2可以看出，在雌性個體頭部組織中，處理組RXR基因表達水平與空白對照組以及陰性對照組相比無顯著性差異。從圖3可以看出，在雌性個體卵巢組織中，處理組RXR基因表達水平與空白對照組以及陰性對照組相比顯著性下降(P ＜0．05)。

3 討論

在脊椎動物中，RXR基因參與多種重要的生理過程，包括胚胎發育、細胞增殖與分化、新陳代謝等。脊椎動物體內的RXR有3種亞型(α、β、γ)，能夠與維生素D受體、甲狀腺激素受體、過氧化物酶體增殖物激活受體、膽汁酸受體等核受體形成異源二聚體發揮調控作用［17］。在甲殼類動物體內，RXR基因能與蛻皮激素形成異源二聚體［18］。目前，關于軟體動物RXR基因的研究主要集中在TBT等有機錫化合物誘導RXR的非正常表達，進而導致性畸變現象［19］。在性畸變后期，由于卵巢內輸精管的產生導致輸卵管阻塞以及卵巢內的精子發生，受到性畸變影響的軟體動物都會出現性腺發育不良的現象，進而出現種族繁育危機［20－22］。筆者主要研究RXR基因在雜色鮑性腺發育過程中的表達情況，結果發現RXR在卵巢、雌性個體頭部組織、雌性個體肝胰腺組織、雄性個體頭組織和雌性個體肝胰腺組織的表達量在增殖期均存在顯著差異，這證實了RXR不僅在脊椎動物體內參與了細胞增值與分化的過程，在軟體動物體內同樣存在該作用，同時也表明增殖期可能是RXR基因在雜色鮑性腺發育過程中起調控作用的的窗口期，為后面的RNA干擾試驗提供了基礎。同時，在雄性個體肝胰腺組織，RXR基因在性腺發育增殖期時表達量顯著下調，這與其他組織的表達情況不同，說明在雄性雜色鮑體內RXR基因在不同組織發揮調控作用的時間點不同，也可能RXR基因在性腺發育過程中有其他作用。

RNA干擾技術能夠快速有效沉默某個基因的表達，進而影響該基因的功能作用。目前，RNA干擾技術已經廣泛地應用在脊椎動物與非脊椎動物中。但是，在軟體動物中，這項技術還處于初步完善的階段。有些腹足類生物神經系統的研究和頭足類觸手肌肉的分化的研究已經使用該項技術;對于雙殼類生物，Fabioux等［5］通過對牡蠣性腺注射vasa-like雙鏈RNA，結果表明注射后的牡蠣生殖細胞不在分化并且過早的出現減數分裂過程，甚至出現不育現象。筆者通過對雌性雜色鮑肝胰腺中間部位注射RXR雙鏈RNA來檢測RXR基因mRNA的表達水平。結果表明，在雌性個體頭部組織中處理組RXR基因表達水平與空白對照組以及陰性對照組相比無顯著性差異;在雌性個體卵巢組織中，處理組RXR基因表達水平同空白對照組以及陰性對照組相比顯著性下降(P＜0．05)。在卵巢中RXR基因表達的顯著性下調，說明RXR雙鏈RNA體外注射能有效沉默卵巢中RXR基因的表達;雌性個體頭部組織中的RXR表達量沒有變化可能有2個方面的原因:注射到取樣間隔時間(48 h)較短，以至于沉默效果還未在雌性個體頭部組織中發揮作用，或者是因為RXR雙鏈RNA在未到達目的組織的時候已經被降解。

綜上所述，筆者研究了RXR基因在雜色鮑性腺發育中的周年表達情況。這些研究結果有助于闡明雜色鮑性腺發育的分子機制，進一步豐富了軟體動物繁殖生物學和水產養殖學的知識，并為軟體動物的性腺分化與發育分子機制的研究提供了理論依據。

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