柴胡組織培養外植體消毒條件的研究

劉茹，曹玲麗，劉霞，舒曉燕，侯大斌(西南科技大學生命科學與工程學院，四川綿陽621010)

柴胡為臨床常用中藥，具有較高的經濟價值。傘形科植物北柴胡(Bupleurum chinense DC.)或狹葉柴胡 Bupleurum scorzonerifolium Willd.)的干燥根是2010年版《中國藥典》一部收載的正品柴胡［1］。藥理研究表明柴胡具有解熱、抗病毒、降血脂、保肝、抗炎、抗腫瘤等作用［2－3］。柴胡化學成分復雜，主要含有皂苷、黃酮、揮發油、有機酸、多糖類等［4－5］。近幾年，藥材市場正面臨著藥用資源短缺的問題，柴胡的馴化栽培已經存在，但長期栽培易導致柴胡品種退化、病害發生，從而導致柴胡產量和品質下降。因此，脫毒培養獲得無毒苗很有必要，再大量繁殖可以恢復品種特性，以滿足生產需要。此外，利用外植體組織培養與超低溫條件可以長期保存，給離體保存的種植資源引種提供方便［6－8］。

組織培養中首先要解決且較難控制的問題是污染，如果不能將污染率降低到一定范圍內，組織培養技術就失去了推廣的意義，工藝也難以進行下去。在自然條件下，作為外植體的植物材料，無論外部還是內部都帶有很多細菌和霉菌。因此，探索外植體的最佳消毒條件是柴胡組織培養的關鍵，也為其進一步研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 供試材料為北柴胡新審定品系“川北柴1號”種子。“川北柴1號”系四川德培源公司選育，在四川多年多點品比試驗中具有良好適應性，該品系已在2014年通過品系審定。

1.2 試驗方法 將“川北柴1號”種子在流水下沖洗4 h，用70%乙醇浸泡50 s，無菌水沖洗3次后浸泡在消毒劑中進行消毒，無菌水沖洗至無明顯顏色出現為止。消毒試驗設計9個處理(表1)。用無菌濾紙吸干消毒處理后種子上的蒸餾水，接種到 MS+1.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA 的誘導培養基中，每個處理接種10瓶，每瓶接種一個外植體，重復3次。培養14 d后統計其污染率和存活率。比較消毒效果，篩選最佳外植體消毒條件。

試驗所用培養基都以MS為基本培養基，以6 g/L瓊脂粉為固化劑，附加30 g蔗糖，pH在5.8～6.0。培養箱溫度在(25±1)℃。光照強度為2 000 lx。光照時間為14 h/d。

表1 不同消毒處理的試驗設計

計算公式:

污染率=(污染的柴胡種子數/接種的柴胡種子總數)×100%

存活率=(存活的柴胡種子數/接種的柴胡種子總數)×100%

2 結果與分析

2.1 不同消毒時間對柴胡外植體的消毒效果 由表2可知，25 g/L NaClO消毒處理柴胡種子5 min的效果最差，污染率為100%;100 g/L NaClO消毒處理柴胡種子30 min的消毒效果最好，污染率低至6.7%，存活率為86.7%。

用100 g/L NaClO消毒處理柴胡種子，不同時間外植體消毒效果見圖1。由圖1可知，隨著消毒時間的增加柴胡外植體污染率降低，最低為6.7%，成活率上升，最高86.7%。因此，消毒時間為30 min時消毒效果最佳。

表2 不同消毒條件對柴胡外植體的影響

2.2 不同濃度NaClO對柴胡外植體的消毒效果 選定30 min為最佳消毒時間，考察不同濃度NaClO的消毒效果，發現NaClO濃度為25 g/L時消毒效果最差，污染率達66.7%。NaClO濃度為100 g/L時消毒效果最好，污染率僅為6.7%，成活率為86.7%。為獲得更好的消毒效果，將Na-ClO濃度提高到200 g/L，發現其污染率升高，而外植體的存活率由86.7%降低為80%(圖2)。因此，消毒劑NaClO最佳消毒濃度為100 g/L。

方差分析表明，NaClO濃度對柴胡外植體消毒的污染率和存活率有極顯著影響(P＜0.01)。消毒時間對柴胡外植體消毒的污染率和存活率有顯著影響(P＜0.05)。

3 結論與討論

植物組織培養中的首個問題就是控制污染率，一般而言，污染率應控制在8%以內，但在實際生產中污染率達20%，有時高達50%，甚至100%［9］。組織培養中消毒劑既要殺滅材料上的病菌，也要易被蒸餾水沖洗掉或自行分解，而且不會損傷或輕微損傷組織，影響其生長。因此，該研究選擇的消毒劑為NaClO，殺菌效果好，且易清除干凈。此外，消毒過程中要選擇合適的濃度和時間，低濃度的NaClO不能使外植體消毒徹底，高濃度又會破壞外植體的細胞，細胞處于自我保護，會產生大量的次生物質，引起細胞毒害，導致外植體褐變甚至死亡。若消毒時間過長會對外植體造成一定程度損傷，產生次生代謝物，毒害細胞，使外植體死亡率增加;如果為了降低死亡率減少消毒時間，就會導致消毒不徹底，污染率升高。因此，消毒劑濃度和消毒時間對組織培養中滅菌過程有顯著影響。選擇合適的消毒劑和相對適宜的消毒時間成為“川北柴1號”組織培養中的關鍵。

該研究選用柴胡種子作為外植體進行組織培養研究，以期為推廣柴胡新品種“川北柴1號”尋求最佳繁殖模式。該試驗采用不同濃度的NaClO對柴胡種子進行消毒處理，得到“川北柴1號”組織培養中最佳外植體消毒條件:100 g/L Na-ClO處理柴胡種子30 min的消毒效果最好，污染率低至6.7%，成活率86.7%。王騰越等［10］研究了土沉香外植體的最佳消毒方法，污染率43.33%，成活率31.67%。李鍵等［11］研究了雷公藤外植體最佳消毒條件，污染率21.08%，成活率65.66%。林妃等［12］研究了花梨木外植體的最佳消毒方法，污染率40.0%，成活率51.4%。因此，相對于這些植物的消毒效果，柴胡組織培養中污染率可以得到控制。這可能是因為該試驗選擇的外植體為柴胡種子，本身體積小，攜帶的細菌少且消毒劑的危害不大。因為組織培養中污染率不僅與消毒劑的濃度及消毒時間有關，也可能是由于接種過程中培養材料被污染或是培養過程中環境的溫度、濕度不合適造成的。所以在組織培養接種過程中要注意工作臺面的干凈，使用鑷子等工具要預先進行乙醇消毒;也要選擇濕度、溫度都適宜且病菌少的環境。此外，組織培養中的存活率不僅與消毒劑及消毒時間有關，也可能是材料本身相對老化或者是培養基激素影響。因此，要保證組織培養中材料低污染率高存活率，除選擇最佳的消毒處理，也須選擇合適的外植體、適宜的生長激素和環境。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典.一部［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:263－264.

［2］楊柳，王雪瑩，劉暢，等.北柴胡化學成分與藥理作用的研究進展［J］.中醫藥信息，2012，29(3):143 －145.

［3］徐獻梅，張雪，楊亮.論柴胡的產地來源及藥理作用［J］.貴陽中醫學院學報，2012，34(4):18 －20.

［4］沃源，姚琳，孫世偉.北柴胡化學成分的研究進展［J］.黑龍江醫藥，2011，21(2):215 －217.

［5］謝東浩，蔡寶昌，安益強，等.柴胡皂苷類化學成分及藥理作用研究進展［J］.南京中醫藥大學學報，2007，23(1):63 －65.

［6］周鐘瑞.植物細胞、組織培養在藥材生產中的應用［J］.中國民族民間醫藥雜志，1994(11):29－31.

［7］張淑紅.植物組織培養及其發展方向［J］.墾殖與稻作，2003(6):43－45.

［8］范玉清，任國華.國內植物組織培養進展概況［J］.晉東南師范?？茖W校學報，2004，19(2):23 －24.

［9］王利民，周毅，陳友龍，等.植物組織培養中消毒劑的運用［J］.貴州師范大學學報:自然科學版，2002，20(1):15 －17.

［10］王騰越，周再知，裘珍飛，等.土沉香組織培養外植體消毒方法的研究［J］.中南林業科技大學學報，2012，32(3):44 －48.

［11］李鍵，李建鵑，吳承禎.等.雷公藤組織培養外植體消毒和選擇［J］.中南林業科技大學學報，2010，30(8):18 －21.

［12］林妃，李敬陽，常勝合，等.花梨木組織培養外植體消毒方法初步探討［J］.基因組學與應用生物學，2013，32(4):522 －525.