處理甜菜加工副產(chǎn)物微生物燃料電池陽極生物膜群落多樣性研究

梅曉雪，吳 迪，王明波

(1.哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150025;2.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040)

近年來，由于化石能源的減少使得人們將目光轉(zhuǎn)向可再生能源。目前主要的可再生能源是從玉米、谷物以及甘蔗等木質(zhì)纖維原料中獲得，這些原料的使用可降低生產(chǎn)成本［1－3］。木質(zhì)纖維原料的主要成分包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。而甜菜渣作為甜菜糖加工過程中的剩余物，由于其較高的碳水化合物和低木質(zhì)素含量，也是一種很有前景的木質(zhì)纖維原料［4］。然而目前甜菜渣由于水分大，不便運輸和貯存，一部分作為反芻動物的飼料被利用。少量甜菜渣制粒后出口，而其他大部分鮮渣就地積壓腐敗，造成資源浪費和環(huán)境污染［5］。目前越來越多的研究關(guān)注甜菜渣的新用途，如利用甜菜渣發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇［6］。此外，甜菜渣再利用產(chǎn)能技術(shù)的研究也包括厭氧產(chǎn)氫、產(chǎn)甲烷［7］等。

微生物燃料電池(Microbial fuel cell，MFC)作為一種新型的能源回收技術(shù)成為研究的熱點。它以陽極上微生物作為催化劑，能夠直接將儲存在有機物中的化學(xué)能轉(zhuǎn)化成電能［8－9］。微生物燃料電池實現(xiàn)了去除廢水中的污染物的同時同步產(chǎn)電，因此這項裝置降低了廢水處理的運行成本［10］。此外，MFC能夠?qū)⒍喾N有機物轉(zhuǎn)化成電能，如葡萄糖、乙酸［11］、蛋白質(zhì)［12］以及秸稈［13］等。簡單的小分子有機物比起復(fù)合物較容易產(chǎn)電［14］。而不同的底物不僅能夠影響MFC的啟動時間、功率密度以及庫倫效率，還能夠影響陽極微生物的群落構(gòu)成［15］。而陽極上附著的微生物對電子傳遞有著重要的影響，因此，分析陽極微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性對研究微生物燃料電池產(chǎn)電性能有重要的意義。

近年來，454 GS-FLX焦磷酸測序技術(shù)的出現(xiàn)，很大程度上提高了微生物群落分析技術(shù)的水平。由于傳統(tǒng)的分析技術(shù)有限的測序量，如變性梯度凝膠電泳(DGGE)等，極大地低估了微生物群落真實的多樣性［16］。這些結(jié)果意味著人們對產(chǎn)電微生物群落的多樣性和結(jié)構(gòu)的認(rèn)識是不全面的。而454焦磷酸測序技術(shù)具有更廉價、通量大等優(yōu)點，可以高效準(zhǔn)確地反映MFC系統(tǒng)中的微生物群落結(jié)構(gòu)［17］。筆者以不同處理下的甜菜渣作為底物，以MFC為研究裝置，考察其產(chǎn)電性能，并通過454焦磷酸測序技術(shù)分析不同處理MFC中形成陽極群落結(jié)構(gòu)差異，探討其運行的可行性、穩(wěn)定性，為甜菜渣處理及回收利用提供新型技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗裝置 試驗在單室無膜的320 ml玻璃瓶反應(yīng)器中進(jìn)行。碳紙作為陽極懸掛在瓶子中央，陰極為碳布陰極，在溶液一側(cè)涂有0.5 mg/cm2的Pt(20 wt%Pt/C)和Nafion(5%)作為催化劑。在陰極與空氣接觸的一側(cè)涂有PTFE，作用是允許空氣通過陰極而防止溶液滲出。陽極與陰極之間通過1 000 Ω外電阻相連。電壓通過與電腦相連的數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)每隔30 min進(jìn)行采集一次并記錄。所有反應(yīng)器均在30℃的恒溫箱里進(jìn)行。

1.2 材料和培養(yǎng)基 取自松花江沉積物上清液作為微生物燃料電池(MFC)接種物啟動并運行反應(yīng)器。陽極室的電解液 為 50mmol/L PBSbuffer:Na2HPO4， 4.58g/L;NaH2PO4·H2O，2.45 g/L;KCl，0.13 g/L;微量元素和維生素。加入底物后pH調(diào)整為7.0。

甜菜渣由黑龍江省某榨糖廠提供。分別將甜菜渣進(jìn)行酸堿預(yù)處理并與未處理的甜菜渣進(jìn)行比較。酸處理為固液比1∶10 g/ml的條件下，用1.7%的硫酸通過高壓滅菌鍋在120℃處理120 min。酸解后保留上清液，離心棄去殘渣。再用Ca(OH)2將水解液pH調(diào)到中性，再次離心除去產(chǎn)生沉淀。堿處理是在固液比為1∶10 g/ml的條件下，用2%的氫氧化鈉在100℃處理1 h后，保留固體部分，殘渣水洗至中性［18］。未處理和堿處理的底物濃度為1 g/L，酸處理的底物濃度為(697±50)mg COD/L(反應(yīng)器初始濃度)。

1.3 DNA提取 反應(yīng)器運行60 d后，從微生物燃料電池的陽極生物膜取樣進(jìn)行群落分析。陽極碳紙被剪下，通過Powersoil DNA 抽提試劑盒(MoBio Laboratories，Inc.，Carlsbad，CA)提取樣本中總DNA。具體方法請參照手冊說明。

1.4 陽極微生物群落454焦磷酸測序 提取出來的總DNA使用通用引物8F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和533R(5'-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3')對3個樣品的細(xì)菌16S rRNA基因V1～V3區(qū)進(jìn)行擴增。通用引物上還包括454接頭A和B、條碼以及連接序列。擴增的目的片段平均長度為455 bp。所有的擴增混合物通過Roche 454 GS－FLX程序裝置進(jìn)行焦磷酸測序。所獲得的序列在不同系統(tǒng)發(fā)育組，例如綱和屬水平進(jìn)行分類，并且按著占每個樣品總序列數(shù)的百分比表示相對豐度。測序數(shù)據(jù)的熱圖通過R heatmap.2(gplots package)軟件繪制。統(tǒng)計學(xué)分析如Chao1和Shannon指數(shù)在核酸相似度為97%通過Mothur軟件生成。稀釋度曲線基于核酸相似度為97%和95%通過Mothur、plot-rarefaction軟件生成，利用Excel軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理下MFC產(chǎn)電性能比較 在單室空氣陰極反應(yīng)器中，以未處理的甜菜作為底物MFC在2 d產(chǎn)電最先達(dá)到最大，電壓為530.1 mV;而堿處理和酸處理的甜菜作為底物時，啟動周期較長，電壓達(dá)到最大分別為566.2 mV和472.5 mV(圖1)。經(jīng)堿處理后的甜菜作為底物運行的反應(yīng)器產(chǎn)生電壓略高于酸處理和未處理對照，此外，在最高電壓時持續(xù)的時間也最長。不同底物下MFC電壓的變化均經(jīng)歷了增長期、穩(wěn)定期和下降期3個時期。此外，未處理和堿處理的甜菜渣MFC的最大功率密度分別為(369±23)mW/m2和(351±20)mW/m2，均高于酸處理的最大功率密度(244±4)mW/m2。結(jié)果說明甜菜渣的不同處理方式對MFC電能的輸出有明顯的影響。

2.2 不同處理陽極群落豐富度和多樣性分析 該研究對3種處理甜菜渣MFC陽極生物膜群落進(jìn)行焦磷酸測序分析。未處理、堿處理和酸處理的MFC微生物群落測得序列讀取數(shù)分別為5 370、6 496和5 182，平均序列長度為455 bp。在核酸相似度為97%時，獲得的操作分類單元(OTUs，operational taxonomic units)數(shù)量分別為965(未處理)、593(堿處理)和999(酸處理)。隨著序列數(shù)量的增加，新的細(xì)菌種系型不斷增加(圖2)。此外，來自未處理、堿處理和酸處理3個樣品陽極群落，經(jīng)Chao1指數(shù)估計的OTU總數(shù)分別為2 228、1 193和2 331。結(jié)果顯示，酸處理的豐富度高于堿處理和未處理。Shannon多樣性指數(shù)不僅能夠表征群落物種的豐富度，還能夠提供物種分布均勻性的信息［19］。3個樣品中酸處理的Shannon多樣性指數(shù)最高為5.30，未處理次之Shannon指數(shù)為4.88，而堿處理的多樣性最低 Shannon指數(shù)僅為3.66。

2.3 不同處理MFC群落結(jié)構(gòu)差異性分析 基于核酸相似度為97%的操作分類單元(OTU，operational taxonomic units)，聚類分析被構(gòu)建用于辨別3個微生物群落結(jié)構(gòu)差異(圖3)。結(jié)果可知，3個樣品被聚為2組，未處理和堿處理被聚為一組，酸處理單獨成為一組。圖3清晰地呈現(xiàn)酸處理組與未處理和堿處理組在群落結(jié)構(gòu)上的差異，盡管在反應(yīng)器啟動時接入了相同的接種物。結(jié)果說明，3個樣品中MFC陽極生物膜群落的形成具有選擇性，不同處理的甜菜渣對微生物群落結(jié)構(gòu)具有顯著性影響。

2.4 不同處理MFC群落系統(tǒng)發(fā)育分類 甜菜殘渣3種處理樣品作為底物，陽極微生物群落在門水平的多樣性分布如圖4所示。3個樣品的細(xì)菌主要分布在14個門。其中變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)為優(yōu)勢門。變形菌門在堿處理的MFC陽極生物膜群落中豐度達(dá)到最大，為72.7%。而擬桿菌門在未處理樣品的陽極生物膜上豐度最高為33.5%。

3種殘渣處理在綱分類水平上呈現(xiàn)了較強的多樣性分布，共有26個綱。δ-Proteobacteria、β-Proteobacteria和Bacteroidia為優(yōu)勢綱(圖5)。其中δ-Proteobacteria在這3個樣品中所占比例均為最高。知名的產(chǎn)電屬Geobacter和Shewanella屬于這個綱。堿處理的MFC陽極生物膜群落在綱的水平δ-Proteobacteria占67.1%，而未處理和酸處理中δ-Proteobacteria相對豐度略低于堿處理，分別為30.0%和32.5%。

不同底物下，陽極上的微生物群落結(jié)構(gòu)與電流的產(chǎn)生密切相關(guān)。3個測序樣品進(jìn)行比對，在生物分類學(xué)屬的水平進(jìn)行分類，所有序列共屬于111個屬(圖6)。優(yōu)勢屬為產(chǎn)電屬Geobacter，在未處理、堿處理和酸處理中所占比例分別為28.7%、66.3%和30.2%。此外，在未處理和堿處理的樣品中檢測到Bacteroides的豐度分別為2.7%和1.4%，已證實Bacteroides為纖維素分解菌，能降解纖維素產(chǎn)生乙酸［20］。Geobacter不能直接利用纖維素，但是可以利用Bacteroides產(chǎn)生的乙酸作為電子供體產(chǎn)電。而在酸處理的MFC陽極生物膜上，產(chǎn)電屬Klebsiella的豐度為5.9%。這個屬可以利用甜菜殘渣酸處理后產(chǎn)生的糖類物質(zhì)產(chǎn)電［21］。此外，酸處理的MFC陽極生物膜中還存在許多的發(fā)酵菌屬，如Petrimonas［22］和Spirochaeta［23］等。這是由于甜菜渣酸處理后可溶性糖的存在易于發(fā)酵菌的富集，而較多的發(fā)酵菌可能導(dǎo)致與產(chǎn)電菌之間對電子供體的競爭，進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)生相對較低的電壓。

3 結(jié)論與討論

木素纖維素原料酸處理的產(chǎn)物主要是可溶性糖和少量的小分子有機酸，堿處理的產(chǎn)物主要是纖維素［18］。可溶性糖作為發(fā)酵底物比起非發(fā)酵底物如乙酸和丁酸能夠形成更加豐富的微生物群落。由于葡萄糖等可溶性糖所固有的發(fā)酵特性使得多種細(xì)菌可以代謝葡萄糖產(chǎn)生可溶性發(fā)酵終產(chǎn)物如乙酸、丙酸和丁酸［15］。在酸處理的MFC中所測得的序列屬于87個屬。在未處理的MFC中由于殘留少量的糖，所以測得屬的數(shù)量(67個)略高于堿處理的MFC(49個)。雖然在酸處理的MFC陽極生物膜群落多樣性較為豐富，然而較多存在的是發(fā)酵菌，影響了產(chǎn)電菌對電子供體的利用，因而導(dǎo)致較低的電量輸出。而在纖維素為主要底物的堿處理MFC中較少存在發(fā)酵菌，該反應(yīng)器最大電壓也最高。

MFC中不同的產(chǎn)電菌存在不同的電子供體和胞外電子傳遞途徑。例如，Desulfuromonas acetoxidans［24］和 Geothrix fermentans［25］能夠代謝多種有機酸如乙酸、丙酸或者乳酸，并能夠利用電極作為電子受體直接產(chǎn)電。而Klebsiella pneumoniae［21］和 Rhodoferax ferrireducens［26］被證實可以利用葡萄糖作為電子供體直接將電子傳遞到電極上。在該研究中，3種底物的MFC陽極生物膜群落中，均以δ-Proteobacteria綱占優(yōu)勢。在MFC中大多數(shù)的產(chǎn)電菌，如Geobacter和Shewanella均屬于這個綱。在屬的水平，產(chǎn)電菌屬Geobacter在3種底物的陽極生物膜上均為優(yōu)勢屬。此外，在酸處理中還存在少量的產(chǎn)電菌屬Klebsiella，這是因為甜菜渣經(jīng)酸處理以后溶液中主要為可溶性糖，Klebsiella能夠直接利用葡萄糖等產(chǎn)電。

不同的底物類型導(dǎo)致MFC陽極生物膜上形成不同的菌群互作類型。而在酸處理的MFC中，發(fā)酵屬Petrimonas［22］和Spirochaeta［23］等能夠代謝可溶性糖產(chǎn)生小分子有機酸如乙酸。在未處理和堿處理的MFC中，Bacteroides屬能夠利用植物多糖如纖維素或者半纖維素產(chǎn)生乙酸等小分子有機酸。MFC中存在的乙酸可以作為Geobacter的電子供體進(jìn)一步被用于產(chǎn)電。該研究說明，甜菜渣不同處理后產(chǎn)生的有機物能夠在微生物燃料電池中產(chǎn)生電能，也證實微生物之間存在互養(yǎng)關(guān)系，即在產(chǎn)電菌和纖維素降解菌之間或者產(chǎn)電菌和發(fā)酵菌之間，而這種互養(yǎng)關(guān)系也有利于底物的降解和電能的產(chǎn)生。

454焦磷酸測序結(jié)果表明，酸預(yù)處理的甜菜渣陽極生物多樣性高于未處理和堿處理。然而酸處理的陽極群落中以發(fā)酵菌居多導(dǎo)致產(chǎn)電較低。聚類分析將3個樣品分為2組，未處理和堿處理的樣品聚為一類，而酸處理的陽極群落與前兩者差異較大，單獨分為一類。陽極微生物之間的互養(yǎng)關(guān)系有利于MFC產(chǎn)電，纖維素降解菌或者產(chǎn)酸發(fā)酵菌能夠產(chǎn)生小分子有機酸，可供給產(chǎn)電菌作為電子供體產(chǎn)電。

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