廣東紫珠中齊墩果酸和熊果酸含量的比較研究

吳方評，蒲艷春(湖南醫藥學院，湖南懷化418000)

廣東紫珠(Callicarpa kwangtungensis Chun)為馬鞭草科(Verbenaceae)紫珠屬(Callicarpa L.)植物，別名萬年青、珍珠風、臭常山、老鴉飯、金刀菜等，生于海拔300～1 600 m的山坡灌木叢或山地，主要分布于浙江、江西、福建、湖北、湖南、廣東、廣西、貴州、云南等地，收載于2010版中國藥典［1］。廣東紫珠地上部分均可入藥，其性味苦、澀、涼，具有收斂止血、清熱解毒和散瘀的作用，用于濕熱黃疸、脅痛不適等癥。經研究發現，紫珠中含有黃酮、酚酸、三萜和苯丙素等類別化合物［2－5］，總黃酮部位是其抗宮頸炎有效部位［6］，三萜部位主要含齊墩果酸和熊果酸等成分［7－8］，有良好的護肝作用和對肝臟的抗脂質過氧化(LPO)作用［9－10］，目前，廣東紫珠護肝產品市場鮮有報道。該試驗采用高效液相色譜法首次對不同產地、不同部位和不同采收期廣東紫珠中齊墩果酸和熊果酸的含量進行同時測定，為廣東紫珠種植時地理條件、采收部位和適宜采收時間的選擇提供指導，也為廣東紫珠資源的合理開發和綜合評價提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象。10個批次的廣東紫珠主要采摘于湖南和江西2個產區，經湖南醫藥學院中藥現代化研究中心汪冶教授鑒定為馬鞭草科植物紫珠。

1.1.2 主要儀器。Agilent1260高效液相色譜儀，G1311B四元泵(帶在線脫氣機)，G4212B DAD陣列二極管檢測器，Agilent漢化版色譜工作站，迪馬 Diamonil C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)色譜柱;電子分析天平(島津 AUW120D);超聲波中藥處理機(LC－350A)。

1.1.3 主要試劑。齊墩果酸對照品(批號110709－201206，供含量測定用)和熊果酸對照品(批號110742－201220，供含量測定用)，由中國藥品生物制品檢定研究院提供;甲醇和乙腈為色譜純(天津賽福瑞科技有限公司);水為重蒸水;其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 色譜分析條件。色譜柱為迪馬Diamonil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈 － 水(95∶5)，流速 0.5 ml/min，進樣量 10 μl，檢測波長210 nm。

1.2.2 對照品溶液的制備。分別精確稱取齊墩果酸4.0 mg、熊果酸4.6 mg于10 ml容量瓶，用甲醇溶解并定容至刻度，即得0.40 mg/ml齊墩果酸儲備液和0.46 mg/ml熊果酸儲備液。

1.2.3 供試品溶液的制備。分別稱取樣品粉末(過40目篩)0.1 g于10 ml容量瓶中，加入甲醇約8 ml，放入超聲波中藥處理機中處理45 min，取出，放置室溫，用甲醇定容至刻度，進樣前用微孔濾膜(0.45 μm)過濾，按“1.2.1”色譜條件進樣。

1.2.4 方法學考察。

1.2.4.1 系統適應性試驗。分別吸取對照品溶液及供試品溶液各10 μl，在“1.2.1”色譜條件下，進樣測定，記錄色譜圖，考察系統適應性。

1.2.4.2 線性關系的考察。分別精密量取 0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 ml的齊墩果酸和熊果酸于 10 ml容量瓶，用甲醇定容至刻度，即得 4.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0、120.0 μg/ml齊墩果酸系列濃度校正液和 4.6、23.0、46.0、69.0、92.0、115.0、138.0 μg/ml熊果酸系列濃度校正液，按照“1.2.1”色譜條件進樣，以濃度 X(μg/ml)為橫坐標、面積響應值Y為縱坐標，分別計算齊墩果酸和熊果酸線性回歸方程。

1.2.4.3 檢測限和定量限的考察。將齊墩果酸和熊果酸對照品溶液逐步稀釋后進樣測定，以色譜圖中信噪比(S/N)為3時的進樣量為最低檢測限(LOD)，信噪比(S/N)為10時的進樣量為最低定量限(LOQ)。

1.2.4.4 穩定性試驗。取同一供試樣品溶液，按“1.2.1”色譜分析條件分別于 0、1、2、4、8、16、24 h 進樣，進樣量 10 μl，測定峰面積積分值，計算RSD。

1.2.4.5 精密度試驗。取按“1.2.3”方法制備的供試品溶液重復進樣7次，計算峰面積的RSD值。

1.2.4.6 重復性試驗。精密稱取0.1 g同一批次的廣東紫珠樣品7 份，按“1.2.3”方法制備供試品溶液，按“1.2.1”色譜條件分析，測定峰面積，計算平均含量和RSD。

1.2.4.7 加樣回收試驗。精密稱取同批次已知含量(齊墩果酸0.241 4 mg/g，熊果酸0.694 4 mg/g)的廣東紫珠6份，分別置于10 ml容量瓶中，并加入齊墩果酸和熊果酸，按照“1.2.3”處理、“1.2.1”色譜條件進樣分析，測定齊墩果酸和熊果酸的含量，計算回收率。

1.2.5 樣品的含量測定。精確稱取不同產地廣東紫珠藥材10批、不同采收期樣品5批，每批藥材取5個平行樣，按照“1.2.3”進行樣品處理、“1.2.1”色譜條件進樣分析，用外標法分別對齊墩果酸和熊果酸進行含量測定。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1 系統適應性試驗。圖1表明，在“1.2.4.1”條件下，樣品色譜圖中齊墩果酸和熊果酸的保留時間分別為16.378和16.932 min，色譜柱的理論塔板數大于6 000，分離度約為1.5，齊墩果酸和熊果酸基線基本能夠分離，峰形對稱，表明此色譜條件可用于齊墩果酸和熊果酸的同時分析。

2.1.2 線性關系的考察。按“1.2.4.2”方法操作，以進樣濃度X(μg/ml)為橫坐標、峰面積Y為縱坐標計算得出齊墩果酸和熊果酸線性回歸方程分別為Y=5.070 5X－2.268 4(R2=0.999 7)、Y=4.081 4X+1.066 2(R2=0.999 3)，表明齊墩果酸和熊果酸分別在0.040 0 ～1.200 0、0.046 0 ～1.380 0 μg范圍內線性良好。

2.1.3 檢測限和定量限的考察。按“1.2.4.3”方法操作，結果表明，齊墩果酸和熊果酸的檢測限分別為0.001 6和0.002 1 μg，定量限分別為 0.005 4 和 0.005 8 μg。

2.1.4 穩定性試驗。按“1.2.4.4”方法操作，計算得出齊墩果酸和熊果酸峰面積的RSD分別為1.73%和1.95%，表明樣品溶液24 h內穩定性良好。

2.1.5 精密度試驗。按“1.2.4.5”方法操作，齊墩果酸和熊果酸對照品峰面積的RSD分別為0.94%和1.13%，表明在此試驗條件下精密度良好。

2.1.6 重復性試驗。按“1.2.4.6”方法操作，測得齊墩果酸和熊果酸含量分別為 0.241 4、0.694 4 mg/g，RSD 分別為1.95%和2.31%(n=7)，表明該方法重復性良好。

2.1.7 加樣回收試驗。由表1～2可見，齊墩果酸、熊果酸的平均回收率分別為98.90%、98.75%，RSD分別為0.64%、0.55%，表明該方法準確、可靠，可用于廣東紫珠中齊墩果酸和熊果酸的含量測定。

表1 廣東紫珠中齊墩果酸的精密度和回收率試驗

2.2 含量測定 從表3～4可以看出，不同產地廣東紫珠樣品中齊墩果酸和熊果酸含量以江西萍鄉種植果實為最高，分別達0.469 9和1.404 8 mg/g，江西萍鄉收割后幼苗中齊墩果酸和熊果酸的含量也較高，分別達0.379 4和1.041 4 mg/g;不同采收期廣東紫珠樣品中齊墩果酸和熊果酸的含量以11月初為最高。

表2 廣東紫珠中熊果酸的精密度和加樣回收率試驗

表3 不同產地廣東紫珠樣品中齊墩果酸和熊果酸的含量

表4 不同采收期廣東紫珠樣品中齊墩果酸和熊果酸的含量

3 結論與討論

3.1 藥材質量控制標志物選擇的考量 廣東紫珠為2010版藥典收藏藥材，以連翹酯苷B和金石蠶苷為標識物來評價廣東紫珠的質量，如開發出相關的護肝產品，該方法選用齊墩果酸和熊果酸作為對該產品質量控制的標識物有一定的意義。

3.2 流動相的選擇 試驗過程中試用了不同的流動相，結果發現流動相為乙腈∶水=95∶5時峰形對稱，出峰時間適宜，雜質峰對被檢測峰干擾小。因此，試驗采用乙腈∶水=95∶5作為流動相。

3.3 提取方法和提取溶劑的優選 該試驗采用乙醇、95%乙醇、50%乙醇、甲醇和50%甲醇作為超聲提取溶劑，結果表明，用乙醇作為提取溶劑在檢測時會出現較大溶劑峰，用50%甲醇作為提取溶劑提取耗時過長。該試驗采用甲醇作為提取溶劑，超聲提取45 min，待測物基本能提取完全。

3.4 藥材采收方式的選擇 從不同產地樣品的分析結果發現，江西萍鄉種植的廣東紫珠中齊墩果酸和熊果酸的含量較高;采收后第2年新長成的幼苗與頭年采收的果實樣品相比，齊墩果酸和熊果酸的含量普遍偏高;從不同采收期樣品分析結果發現，11月初采收的廣東紫珠齊墩果酸和熊果酸的含量較高。以上分析結果對廣東紫珠藥材的種植環境、采收時間等的選擇有一定的指導作用，對廣東紫珠藥材資源的開發和合理利用也有一定的意義。

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