金線蓮多糖提取工藝研究

李 萍，潘曉麗，鄭小香，李 健，馬玉芳，黃一帆

(福建農林大學中西獸醫結合與動物保健福建省高校重點實驗室，福建福州350002)

金線蓮(Anoectochilus roxburghii(wal1.)Lind1.)又稱花葉開唇蘭、金絲草、金蠶、金不換、烏人參、金線入骨消等，是蘭科開唇蘭屬的一種多年生草本植物。金線蓮以全草入藥，在民間被視為珍稀名貴藥材，其藥用價值倍受人們青睞，有“藥王”之稱。其味甘、性平，具有清熱涼血、祛風利濕、強心利尿、固腎、平肝等功效［1－2］。多糖(polysaccharides)是生物體內普遍存在的一類生物大分子物質，廣泛存在于動物、植物和微生物細胞中，具有抗腫瘤、抗病毒、降血糖、抗炎、抗氧化以及免疫調節等功能［3－4］。Hsieh等研究表明金線蓮水提物能夠調節炎癥細胞浸潤和過敏反應及調節T細胞亞群等［5］;Yang等研究發現金線蓮水提物可以防止骨質流失［6］和益生腸道菌群的作用［7］;Cui等研究表明金線蓮水提物具有降血糖［8］、抗腫瘤以及免疫調節活性［9］;劉青等通過試驗證明金線蓮多糖在體外試驗中有清除自由基及抗氧化作用［10］。綜上所述，金線蓮廣泛的藥理活性很可能與其高含量的多糖有關。林麗清等研究表明金線蓮粗多糖生藥量為37.45%［11］。目前已有許多關于金線蓮多糖提取工藝研究［12－13］，如趙保發等以乙醇回流過的藥渣為材料，分別用響應面法和正交試驗法對金線蓮多糖提取工藝進行研究［13］;李德華等以金線蓮水溶性多糖含量為指標，用正交試驗法對煎煮過程中水的用量、浸提時間、提取次數進行考察［14］。但考慮到煎煮過程中高溫對多糖會有一定的破壞作用，且從金線蓮全草中提取金線蓮多糖工藝研究鮮有報道，因此，對金線蓮多糖提取工藝進行研究具有重要的意義。該研究擬以金線蓮全草為試驗對象，以粗多糖提取率作為評價指標，采用正交試驗設計從浸提溫度、浸提時間、料液比3個方面優化金線蓮多糖的提取工藝，為金線蓮多糖的進一步開發利用提供數據借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑。金線蓮(購自福建南靖)，D-葡萄糖標準品(購自福建省藥檢所)，無水乙醇、丙酮、乙醚、苯酚、濃硫酸等均為國產分析純。

1.1.2 儀器。電子天平(梅特勒－托利多儀器上海有限公司);純水機(Milli-Q);數顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司);SHZ-Ⅲ型循環水真空泵(上海亞榮生化儀器廠);旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠);恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠);冷凍離心機ALLEGRA X-22R(Beckman，USA);TU-1810紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司);真空干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 金線蓮多糖提取工藝。金線蓮全草→干燥→粉碎→蒸餾水浸提→抽濾→濃縮→醇沉→離心→復溶→多糖溶液(供試樣品)。

1.2.2 金線蓮多糖提取。精確稱取金線蓮粉末1.0 g于錐形瓶中，加入一定體積的蒸餾水，置水浴鍋中，浸提一定時間后抽濾，殘渣用少許蒸餾水洗滌2次，合并濾液，旋轉蒸發儀濃縮至100 ml，取2 ml加入8 ml無水乙醇，過夜，離心(3 000 r/min，15 min)，沉淀用蒸餾水復溶后于100 ml容量瓶中定容，得金線蓮多糖供試溶液。

1.2.3 金線蓮粗多糖提取率的測定。金線蓮多糖的測定采用苯酚—硫酸法［15］。

1.2.3.1 苯酚溶液的配制。取苯酚5.0 g，溶于一定體積的水中，并定容至100 ml棕色容量瓶中，搖勻，即得5%苯酚溶液，轉移至棕色瓶中避光，冷藏。

1.2.3.2 葡萄糖標準溶液的配制。將100 mg的D-葡萄糖標準品加蒸餾水溶解，并定容于100 ml容量瓶中，得濃度為1 mg/ml的葡萄糖標準溶液。

1.2.3.3 葡萄糖標準曲線的制作。分別取1 mg/ml葡萄糖標準溶液 1、2、3、4、5、6、7、8 ml于100 ml容量瓶中，蒸餾水定容。精密吸取蒸餾水或上述供試液2.0 ml于試管中，分別加入5%苯酚溶液1.0 ml，搖勻，沿管壁迅速加入濃硫酸5.0 ml，混勻，置沸水浴中加熱15 min。冷卻至室溫后，在490 nm波長處測吸光度，以吸光度(y)為縱坐標、葡萄糖濃度(x)為橫坐標進行線性回歸分析，得出回歸方程，并做出標準曲線［16－17］。

1.2.3.4 金線蓮多糖提取率的計算。金線蓮多糖提取率=100%。

1.2.4 單因素試驗。浸提溫度采用 60、70、80、90、100 ℃ 5個水平，浸提時間采用1、2、3、4、5 h 5個水平，料液比采用1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 分別進行單因素試驗。

1.2.5 正交試驗［18］。在上述單因數試驗的基礎上，選定三因素三水平作正交試驗，優選出金線蓮水溶性多糖提取的最佳工藝。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線 從圖1可以看出，葡萄糖在490 nm處，10～70 μg/ml范圍內與吸光度呈良好的線性關系，擬合方程為 A=0.013 9C －0.014 4，相關系數 R2=0.998 7。

2.2 單因素對多糖提取率的影響

2.2.1 浸提溫度對金線蓮多糖提取率的影響。從不同浸提溫度對金線蓮粗多糖提取率的影響(圖2)可以看出，60～90℃間隨著溫度的升高，金線蓮粗多糖的得率不斷增加，在90℃時達最大，但在100℃時又略有下降，故浸提溫度以90℃為宜。

2.2.2 浸提時間對金線蓮多糖提取率的影響。從圖3可以看出，浸提時間在1～4 h時，金線蓮多糖的提取率逐漸增高，在4 h時金線蓮多糖的提取率最高，在5 h時略有下降。說明浸提時間并不是越久越好，且以4 h為宜。

2.2.3 料液比對金線蓮多糖提取率的影響。由料液比對金線蓮多糖提取率的影響(圖4)可見，料液比在1∶20時多糖提取率最高，為最適料液比。

2.3 正交試驗設計優化金線蓮粗多糖提取工藝 在上述單因素試驗的基礎上，浸提溫度、浸提時間和料液比3個因素各選取3個水平制定因素水平表(表1)。按此正交表安排試驗，以多糖得率作為衡量提取效率的指標，對金線蓮多糖的提取工藝進行優化。為了提高試驗的可靠性，每一條件下均做重復試驗3次(n=3)，測定結果取其平均值供統計分析用。

表1 正交試驗因素水平表

表2 正交試驗結果及分析

正交試驗極差分析(表2)顯示，3個因素對金線蓮多糖提取率影響的主次順序為浸提溫度＞浸提時間＞料液比，金線蓮多糖提取的最佳工藝為浸提溫度90℃、浸提時間4 h、料液比1∶20;驗證試驗顯示，在此條件下，3次試驗的提取率平均值為28.47%。

由正交試驗的方差分析結果(表3)可見，溫度對金線蓮多糖提取率的影響差異性顯著，且影響最大，其次是浸提時間，這與上述的極差分析結果一致。時間和料液比對金線蓮多糖提取率的影響不大，差異不顯著。

表3 正交試驗方差分析

3 結論與討論

單因素試驗結果表明，對浸提溫度進行考察發現，隨著溫度的增高，金線蓮粗多糖的得率呈上升趨勢，在90℃時達最大，但在100℃時又略有下降，可能是由于高溫破壞了部分多糖的結構，從而使金線蓮粗多糖提取率下降，故浸提溫度以90℃為宜;對浸提時間進行考察發現，浸提時間在1～4 h時，金線蓮粗多糖的提取率逐漸增高，而在5 h時略有下降，說明浸提時間并不是越久越好，且以4 h為宜;對料液比進行考察發現，料液比在1∶20時多糖提取率最高，表明水過多或過少均會影響多糖的溶出，故料液比以1∶20為宜。

正交試驗結果表明，金線蓮多糖提取的最佳工藝條件為浸提溫度90℃、浸提時間4 h、料液比1∶20;驗證試驗顯示，在此條件下，3次試驗的提取率平均值為28.47%。這與單因素試驗結果一致，證明試驗結果可靠。通過該試驗的研究，優化了金線蓮多糖的提取工藝，不僅提高了金線蓮原材料的利用率，也為金線蓮多糖生理活性方面的研究奠定了基礎，具有十分重要的意義。

此外，此次試驗所測得的金線蓮粗多糖的提取率較某些文獻中報道的提取率偏高［19－22］。這與金線蓮的產地、培養時間等不同有關。陳曉蘭等研究表明不同產地金線蓮根莖和葉中多糖的含量有所不同［19］。黃瑞平等研究發現不同月齡金線蓮多糖的含量有所不同［20］;金線蓮在移栽培養5個月時，多糖含量最高［21］;組培金線蓮樣品中的多糖遠高于野生金線蓮樣品［22］;林麗清等研究表明金線蓮粗多糖生藥量為37.45%，精制金線蓮多糖生藥量也可達 27.14%［11］。

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