p66Shc基因調控早期胚胎發育阻滯的研究進展

胡軍和，陽仲斌，李 偉，金晨鐘，曾 智，吳 娟，張雪嬌，王 艷 (湖南人文科技學院農業與生物技術學院，湖南婁底417000)

p66Shc基因最早是由Migliaccio等在1999年提出的。研究表明，在小鼠食物攝入和體重無明顯變化的情況下，p66Shc基因敲除小鼠的壽命要比對照組小鼠的壽命延長30%，為此命名該基因為“長壽基因”［1］。p66Shc(66-kilodalton isoform of Shc gene products)基因編碼一種磷酸化酪氨酸信號適配蛋白，已發現與之相關的3種Shc基因:ShcA、ShcB(Sli)和ShcC(Rai)［2］。p66Shc(66-kilodahon isoform of Shc gene products)是哺乳動物的原癌基因SHC編碼3個分子量相近的ShcA蛋白質家族(p46Shc、p52Shc和 p66Shc)中3個成員之一［1］。近年來，隨著研究的深入，人們發現p66Shc蛋白在由氧化應激引起的細胞凋亡過程中發揮重要的作用，而且該蛋白的表達水平與其氧化水平呈線性關系［3］。在胚胎早期發育過程中，活性氧(Reactive oxygen species，ROS)是導致胚胎體外發育阻滯的重要原因之一［4］。在正常生理狀態下，哺乳動物胚胎在體內發育環境(輸卵管和子宮)的含氧量一般為5% ～8%，可見胚胎內ROS水平的高低對其發育非常重要。

1 p66Shc的分子結構及功能

p66Shc的分子結構組成包括PTB(an N-terminal phosphotyrosine-binding domain)、CH1(a central proline-rich domain)、SH2(a carboxy terminal Src homology 2)和CH2(an additional N-terminal proline-rich domain)，主要通過酪氨酸激酶信號通路調控有絲分裂等細胞生物學事件。其中的SH2結構域是發揮功能的主要結合靶位點(如EGF受體或ErbB-2)，PTB結構域可以綁定到磷脂，這說明磷脂酰肌醇3激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)能夠在激活SHC基因中發揮作用;SH2結構域和EGF受體酪氨酸激酶的激活對CH1結構域中的酪氨酸激活具有重要的作用［5］。同時，在p66Shc蛋白上包含2個絲氨酸磷酸化位點(位于CH2結構域中36位絲氨酸和PTB結構域中108位絲氨酸)，其中第1個位點與氧化應激反應有密切的關系，能夠影響胞內ROS水平和對UV射線的反應，而且能夠被MAPK(Mitogen-activated protein kinase)信號通路調節，并且通過相互作用調控細胞的凋亡［6］。叉頭轉錄因子(Forkhead transcription factor)是36位絲氨酸－磷酸化p66Shc下游調控的主要靶作用位點，這些叉頭轉錄因子家族至少包含80個成員，這些成員在調控凋亡及氧化有著復雜的作用。在淋巴細胞中，細胞因子能夠激活叉頭轉錄因子FKHR-L1(Forkhead(Drosophila)homolog(rhabdomyosarcoma)like 1)，這個轉錄因子通過調控凋亡蛋白BIM(Bel-interaetion mediator)的表達，從而引起線粒體膜的破壞，引起細胞凋亡的發生［7］。同時，也有很多研究表明p66Shc能夠通過作用于線粒體調節胞內的ROS水平的高低，引起細胞凋亡或衰老的發生［5］。具體的分子結構及其調控作用型號通路如圖1所示。

由此可見，通過p66Shc基因中36位的絲氨酸發生磷酸化，可以提高細胞內ROS水平和激活MAPK通路，同時也能促進叉頭轉錄因子活性的升高，從而加強叉頭轉錄因子調控的相關蛋白(如凋亡蛋白BIM等)的表達，導致細胞內其ROS水平升高和細胞發生凋亡。

2 p66Shc調控活性氧水平研究進展

p66Shc已被研究證實在細胞的氧化應激應答中起重要作用，通過叉頭轉錄因子家族調節胞內氧化還原平衡及凋亡［8］。p66Shc在氧化應激狀況下調節FoxO(Forkhead box class O)轉錄因子的活性，而FoxO是PI3K-AKT-FoxO信號轉導途徑中的環節［9］。p66Shc上的絲氨酸磷酸化位點的磷酸化狀態直接影響著其信號適配功能，從而參與細胞的凋亡調控，而p46/p52Shc通過與細胞表面的有絲分裂信號受體結合從而參與Ras-MAPK(Mitogen activated protein kinase)信號轉導途徑，此途徑影響細胞的增殖和分化［10］。研究表明，p66Shc是P53的下游調控作用因子，2種一起調控ROS水平及細胞凋亡的發生，因為敲除2個基因的細胞內的氧化損傷及DNA斷裂顯著減少［11］。但是，后來的研究結果卻與之不同，認為P53在調控ROS的水平方面未充分發揮作用，主要是p66Shc的作用所引起的［5，12］。最近研究發現，p66Shc的功能主要在于其蛋白特異的N端結構能夠形成一個氧化結構單元(這個結構單元能夠引起凋亡的發生)，其結構單元能夠被2個二硫化物結合形成可變化四聚體化引起激活。其中，谷胱甘肽和硫氧還蛋白的作用能夠減弱或滅活p66Shc的氧化應激反應，從而形成一個以硫醇發揮氧化還原作用的傳感發生裝置，來對包內的ROS水平做出相應的調節反應，導致相應功能反應［3］。有關其調控機制的研究，有報道認為主要通過絲裂原激活蛋白激酶－激活蛋白激酶2(Mitogen activated protein kinase-activated protein kinase 2，MAPKAP-2)作用發揮其調控作用，因為通過免疫共沉淀能夠得到2種蛋白的復合體［13］。盡管具體的調控網絡不是很清楚，目前大多數研究表明Shc基因表達主要受ROS水平的調節，然后發生磷酸化二激活，同時表帶的不同蛋白產物作用方式和功能也不同，如p66Shc可作用于線粒體引起凋亡的發生等。

3 p66Shc調控胚胎發育阻滯的調控網絡

Favetta等［12］研究發現有13．5%左右的牛體外生產胚胎阻滯在2－4細胞階段，一般第一次胚胎分裂發生在激活后的26～48 h，雖然在開始只有大約0．6%比例的胚胎發生阻滯發育，但是在后來的阻滯卻有大約14．2%的胚胎發生阻滯;采用實時定量PCR檢測這2種阻滯的胚胎，結果表明其p66ShcmRNA的表達都顯著高于對照組，但是其p53 mRNA的表達及蛋白的磷酸化等沒有明顯變化，由此可見其由ROS水平升高引起胚胎的發育阻滯主要在于p66ShcmRNA的表達，而與p53 mRNA及蛋白的表達關系不大。同時，以牛IVF胚胎作為對照組，通過在牛GV期的卵母細胞中注射12 000～24 000個短的發夾式反義RNA p66Shc分子研究其p66Shc分子對由ROS引起的胚胎發育阻滯的影響研究發現，Real-time PCR結果表明試驗組的p66Shc的mRNA表達顯著低于對照組，但是其內參基因的表達沒有差異，同時其熒光染色發現其試驗組的熒光顯著弱于對照組;在試驗組中胚胎發育阻滯的比例顯著低于對照組，但是在囊胚階段其p66ShcmRNA的表達沒有顯著差異［14］。利用發生胚胎發育阻滯的牛胚胎為研究材料，研究其胚胎內ROS水平與胚胎發育阻滯的聯系，其結果發現胚胎在20%的氧濃度下培養會使得其氧化刺激提高近10倍，相應發現在2－4細胞發生阻滯的胚胎比例提高2倍，同時其發育潛能顯著低于在5%氧濃度下培養的胚胎;同時，p66ShcmRNA的表達檢測發現，其20%氧濃度下顯著高于5%的表達水平，但是其p53的表達在2種條件下顯著差異［5］。總之，在胚胎培養過程中會產生大量的ROS(如可見光、氨基酸氧化物等)，這些胚胎內ROS水平的升高可能是胚胎在發育過程中發生阻滯現象的重要原因之一。由此可見，胚胎發育阻滯在體外培養胚胎中是一種普通現象，而且與ROS產生及其水平密切相關。

由此可見，p66Shc是外源氧化物質誘導細胞或胚胎內部發生由ROS引起細胞損傷反應的主要作用靶點，能夠誘導p66Shc基因表達的加強，從而調控作用于線粒體膜的因子的表達。這些因子作用于線粒體膜后，引起線粒體膜的破壞，導致細胞凋亡的發生，影響其功能的發揮。

總而言之，目前人們胚胎早期發育阻滯的機理不是很清楚，一般認為是由于在胚胎發育過程中合子基因的表達沒有有效啟動，但是具體的靶基因及相互調控關系也不清楚。盡管已有研究發現p66Shc基因與細胞或胚胎內ROS的產生存在某些聯系，但是有關胚胎p66Shc通過調控ROS影響胚胎合子基因表達機制還不是很清楚，有待于進一步研究。

［1］MIGLIACCIO E，GIORGIO M，MELE S，et al．The p66Shcadaptor protein controls oxidative stress response and life span in mammals［J］．Nature，1999，402(6759):309 －313．

［2］PHILLIPS J P，CAMPBELL S D．Null mutation of copper/zinc superoxide dismutase in Drosophila confers hypersensitivity to paraquat and reduced longevity［J］．Proceedings of the National Academy of Sciences，1989，86(8):2761．

［3］GERTZ M，FISCHER F．Activation of the lifespan regulator p66Shcthrough reversible disulfide bond formation［J］．Proceedings of the National Academy of Sciences，2008，105(15):5705 －5709．

［4］HERNANDEZ-GARCA D，WOOD C D．Reactive oxygen species:A radical role in development?［J］．Free Radical Biology and Medicine，2010，49(2):130－143．

［5］FAVETTA L A，ST JOHN E J，KING W A，et al．High levels of p66Shcand intracellular ROS in permanently arrested early embryos［J］．Free Radical Biology and Medicine，2007，42(8):1201 －1210．

［6］VENTURA A，LUZI L，PACINI S，et al．The p66Shclongevity gene is silenced through epigenetic modifications of an alternative promoter［J］．Journal of Biological Chemistry，2002，277(25):22370 －22376．

［7］DIJKERS P F，BIRKENKAMP K U，LAM E W F，et al．FKHR-L1 can act as a critical effector of cell death induced by cytokine withdrawal protein kinase B enhanced cell survival through maintenance of mitochondrial integrity［J］．The Journal of Cell Biology，2002，156(3):531 －542．

［8］PURDOM S，CHEN Q M．Linking oxidative stress and genetics of aging with p66Shcsignaling and forkhead transcription factors［J］．Biogerontology，2003，4(4):181 －191．

［9］NEMOTO S，FINKEL T．Redox regulation of forkhead proteins through a p66Shc-dependent signaling pathway［J］．Science’s STKE，2002，295(5564):2450．

［10］MIGLIACCIO E，MELE S，SALCINI A E，et al．Opposite effects of the p52shc/p46shc and p66Shcsplicing isoforms on the EGF receptor-MAP kinase-fos signalling pathway［J］．The EMBO Journal，1997，16(4):706 －716．

［11］TRINEI M，GIORQIO M，CICALESE H，et al．A p53-p66Shcsignalling pathway controls intracellular redox status，levels of oxidation-damaged DNA and oxidative stress-induced apoptosis［J］．Oncogene，2002，21(24):3872 －3878．

［12］FAVETTA L A，ROBERT C，ST JOHN E J，et al．p66Shc，but not p53，is involved in early arrest of in vitro-produced bovine embryos［J］．Molecular Human Reproduction，2004，10(6):383．

［13］YANNONI Y M，GAESTEL M，LIN L L．P66ShcA interacts with MAPKAP kinase 2 and regulates its activity［J］．FEBS Letters，2004，564(1/2):205－211．

［14］FAVETTA L A，MADAN P．The oxidative stress adaptor p66Shcis required for permanent embryo arrest in vitro［J］．BMC Developmental Biology，2007，7(1):132．