四川省具有子根莖重樓的資源調查及品質研究

陳鐵柱，林 丹，汪 瑤，文飛燕，張驛帆，張 浩*

(1．四川省中醫藥科學院，四川成都610041;2．四川大學華西藥學院，四川成都610041)

重樓是西部藥用植物中占據產業化利用主導地位、最具代表性和全局影響力的藥用植物資源之一。但其植物資源嚴重枯竭，目前已有一定數量的公司和個人開始了試驗性研究，進行大規模的引種栽培。但栽培現狀比較混亂，主要體現在繁殖方式上，即野外采挖直接種植、根莖切割繁殖［1］、全根莖切割［2］、種子繁殖［3－5］，以上 4 種繁殖方式均不能打破重樓的生物學特性(生長緩慢、生長周期長、繁育系數低)，其目前的繁殖方式已經嚴重制約了其資源再生和產業化發展。然而，經長期野外調研和產地調查發現，在極其特定的環境下，重樓根莖會自然分根，即一個根莖上分根3～15株不等子根莖。子根莖移栽后，表現了明顯的速生性，3～4年后即可作商品藥材。此種分枝繁殖的方式提高了重樓3～15倍的繁殖系數，縮短了重樓6～7年的生育周期，產業化栽培前景非常好。筆者擬對能分枝繁殖出子根莖的重樓的環境因子和內在因子進行研究，明確分枝繁殖重樓的具體環境生態條件，通過有效成分含量測定分析，明確是否有藥用價值，以期為產業化生產提供理論基礎和技術保障，為實現重樓資源再生策略和行動方向提供有效的借鑒手段和方法。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 藥材來源。在查詢標本的情況下設定的走訪調查后，采到的具有子根莖的重樓藥材產地為四川省彭州市白鹿鎮、四川省崇州市街子古鎮和雞冠山鎮(表1)，由四川大學華西藥學院生藥學教研室張浩教授進行原植物鑒定。留樣憑證標本存放于生藥學標本室，所有樣品均有原植物數碼照片。

表1 子根莖重樓樣品來源

1．1．2 儀器。LG－10A日本島津高效液相色譜儀;島津LabSolution色譜工作站;D1810D自動純水蒸餾器。

1．1．3 試劑。重樓皂苷I、II對照品購自中國藥品生物制品檢定所，其余6個皂苷對照品均為華西藥學院生藥201－203#實驗室人員分離得到(圖1)，分別為化合物1(重樓皂苷Ⅶ)、化合物2、化合物3(重樓皂苷H)、化合物4(重樓皂苷Ⅵ)、化合物5(重樓皂苷Ⅱ)、化合物6(纖細薯蕷苷)、化合物7(重樓皂苷Ⅰ)、化合物8(重樓皂苷Ⅴ)。乙腈為色譜純;甲醇為色譜純;水為雙蒸水。

圖1 重樓皂苷對照品1～8分子結構

1．2 方法

1．2．1 資源調查方法。

1．2．1．1 文獻檢索查證，確定調查區域。通過查閱中國數字植物標本館及四川省中醫藥科學院標本館重樓標本，以及走訪成都荷花池藥材市場的市場信息人員，明確了四川省重樓主要分布區域，確定了四川省洪雅市、峨眉山市、屏山縣、天全縣、蘆山縣、寶興縣、崇州市、邛崍市、彭州市、大邑縣、什邡市、安縣、巴中市為主要調查區域。

1．2．1．2 走訪調查。走訪調查當地藥農、藥材收購點、藥材公司、飲片加工企業、農業局、科技局、藥監局等相關工作人員，了解野生重樓資源的分布情況。并走訪當地氣象部門，查閱氣候資料，了解當地氣候變化情況。

1．2．2 品質測定方法。

1．2．2．1 色譜條件的確立。含量測定前系統適應性各項考察均參照《中國藥典》一部(2010年版)重樓藥材項下的含量測定相關操作［6］以及劉顯波的方法［7］進行。色譜條件為色譜柱Kromasil C18柱(250×4．6 mm，5 μm)，Dikma C18保護柱(12．5 ×4．6 mm，5 μm);流動相為A(乙腈)∶B(水)二元梯度洗脫，梯度洗脫程序如表2所示;流速1．0 ml/min;柱溫35℃。氮氣流速為3．0 ml/min。檢測器漂移管溫度設置為102℃。進樣體積為20 μl。

表2 梯度洗脫條件

1．2．2．2 對照品溶液制備。精密稱取各種皂苷對照品，用色譜甲醇定容于2 ml容量瓶中，制備混合對照品溶液，備用。1 ～8 號對照品濃度分別為 1．57、1．75、2．70、0．92、1．46、1．80、0．80、1．22 mg/ml，其色譜圖如圖 2 所示。

1．2．2．3 供試品溶液的制備。重樓樣品低溫干燥后打粉過篩(40目)。精確稱量粉末約0．50 g，加入50 ml甲醇，浸泡4 h后超聲提取30 min，過濾。重復上述操作1次，合并濾液，回收至干。加入色譜甲醇溶解并定容至10 ml，經0．45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液作為供試品溶液。

1．2．2．4 線性關系考察。精密吸取“1．2．2．2”混合重樓皂苷對照品溶液4、6、10、12、16、20 μl注入高效液相色譜儀，測定其峰面積值，以進樣量(μg)為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，進行回歸分析得回歸方程，其線性回歸方程、相關系數、線性范圍如表3所示。

圖2 1～8號對照品溶液色譜圖

表3 對照品標準曲線數據

1．2．2．5 精密度試驗。精密吸取“1．2．2．2”混合重樓皂苷對照品溶液，分別在“1．2．2．1”色譜條件下連續進樣 6 次，每次進樣20 μl，分別測定峰面積，計算皂苷1～8號對照品的RSD 分別為 1．65%、1．01%、1．25%、2．01%、0．94%、1．83%、1．21%、1．78%，均小于3%，表明進樣精密度良好。

1．2．2．6 重復性試驗。精密稱取同一批樣品(HCS1)6份，均按《中國藥典》2010版本重樓項下含量測定方法相關操作［6］制備供試品溶液，在“1．2．2．1”色譜條件下測定 8 種重樓皂苷的峰面積，計算皂苷1～8號的RSD分別為1．32%、1．04%、1．75%、1．43%、1．21%、1．63%、2．14%、2．35%，表明方法的重復性較好。

1．2．2．7 穩定性試驗。取同一批樣品(HCS1)溶液，間隔0、4、8、24、48 h，進樣5 次，每次 20 μl，按照“1．2．2．1”色譜條件進行測定。計算皂苷1～8號的RSD分別為0．74%、0．45%、0．78%、0．83%、0．64%、1．17%、0．95%、1．25%，表明供試品溶液穩定性良好。

1．2．2．8 加樣回收試驗。精密稱取6份已測知含量的同一批華重樓藥材(HCS1)，精密加入皂苷1、3、5、7號的對照品溶液適量，按《中國藥典》2010版重樓項下含量測定方法相關操作［6］制備供試品溶液，在“1．2．2．1”色譜條件下測定 4種重樓皂苷的峰面積，計算皂苷1、3、5、7號對照品的加樣回收率分別為 97．41%、96．84%、97．73%、98．81%;RSD 分別為1．83%、2．04%、1．45%、1．79%。

1．2．2．9 樣品測定。精密稱取不同重樓藥材粉末約0．50 g。按“1．2．2．3”方法制備供試品溶液，按“1．2．2．1”色譜條件進樣20 μl，測得1～8號供試品色譜峰的峰面積，算出各樣品皂苷含量。

2 結果與分析

2．1 子根莖重樓的資源調查產地條件分析

2．1．1 分布條件。調查結果發現，具有子根莖的重樓主要集中分布在四川省的彭州市和崇州市，子根莖重樓資源分布范圍較廣，北至彭州市的白鹿鎮、南至崇州的雞冠山鎮，103°22'48″～103°54'57″E、30°37'48″～31°12'43″N 區域內低山至高山均有分布，集中分布在海拔533～1 220 m的區域，土壤以弱酸性山地黃棕壤為主，土質疏松肥沃(表4)。

表4 子根莖重樓資源的小生態環境

2．1．2 氣候條件。子根莖重樓主要分布在亞熱帶季風帶氣候區(表5)。夏季較涼爽、冬季不嚴寒，年均溫度變化比較平緩，較少出現極冷極熱現象，年降水量比較充足(960～1 012 mm)，相對濕度較大(70% ～82%)，年平均溫度15．7～15．9 ℃，最冷月平均氣溫5．4 ～7．5 ℃，最熱月平均氣溫25．0～26．2℃，年均日照時數為1 161～1 180 h，無霜期278～285 d，以上條件為子根莖重樓適宜的生長條件。

表5 子根莖重樓分布區的氣象數據

2．1．3 土壤條件。土壤類型主要是山地黃棕壤，pH變化范圍為5．23～5．68(表4)，弱酸性。黃棕壤是最有利于重樓子根莖的生成，此種類型的土壤土層較厚、有機質含量高，其垂直結構為0～6 cm為枯枝落葉層、6～18 cm為腐殖層、18～39 cm為過渡層、39～100 cm為淀積層，為重樓的生長提供了足夠的營養，促進形成子根莖。

2．2 子根莖重樓中皂苷含量分析

2．2．1 不同產地子根莖華重樓中皂苷含量。彭州10組具有子根莖的華重樓(HCS1)化學物1～化合物8均有檢出，重樓皂苷(Ⅰ+Ⅱ+Ⅵ+Ⅶ)的總量均達0．980 9%(表6)，達到《中國藥典》2010版重樓項下規定的最低0．60%的限量標準。同時，對從彭州8組具有子根莖的華重樓摘下子根莖(HCB2)進行了檢測，發現HCB2重樓皂苷(Ⅰ+Ⅱ+Ⅵ+Ⅶ)的含量不足HCB1的50%。對4批次崇州街子古鎮具有子根莖的華重樓(HCJ1～HCJ4)進行檢測，每次均檢測出重樓皂苷Ⅶ、化合物2和重樓皂苷H，2014年10月采收的華重樓(HCJ2)重樓皂苷(Ⅰ+Ⅱ+Ⅵ+Ⅶ)含量為1．123 0%，是崇州街子古鎮4批次檢測樣品中唯一符合《中國藥典》重樓項下0．6%的限量標準的樣品。崇州市雞冠山鎮具有子根莖的華重樓重樓皂苷(Ⅰ+Ⅱ+Ⅵ+Ⅶ)含量為0．094 2%，為檢測的8個批次子根莖華重樓中含量最低的。崇州市雞冠山鎮具有子根莖的華重樓為一根雙株，皂苷含量低可能是雙株消耗了過多的營養，導致生成的重樓皂苷含量低。

2．2．2 同一產地具有子根莖的不同品種重樓皂苷含量。經實地調查(表6)，崇州雞冠山鎮這一特定產地，發現5個重樓品種中某一單株均有子根莖現象，且子根莖發育成雙株或多株重樓。除了對具有子根莖的華重樓測定外，對具有子根莖且多株的卷瓣重樓、狹葉重樓、五指蓮、黑籽重樓皂苷含量也進行了測定。測定結果發現，只有雙株子根莖黑籽重樓皂苷(Ⅰ+Ⅱ+Ⅵ+Ⅶ)含量達到了《中國藥典》重樓項下0．6%的限量標準，其他品種均未合格。對具有子根莖黑籽重樓主根中摘除的小根莖進行了測定，發現重樓皂苷(Ⅰ+Ⅱ+Ⅵ+Ⅶ)含量不足主根莖的50%，與子根莖華重樓測定結果趨勢一致。

表6 重樓樣品中8種皂苷的含量%

3 結論與討論

(1)對有多芽分根繁殖的重樓區域進行調查，發現根莖重樓適宜的生長條件為在 103°22'48″～ 103°54'57″E、30°37'48″～31°12'43″N 533 ～1 200 m 的區域，土壤以弱酸性山地黃棕壤為主，年平均溫度15．7～15．9℃，最冷月平均氣溫5．4～7．5 ℃，最熱月平均氣溫25．0 ～26．2 ℃，年均日照時數為1 161～1 180 h，無霜期278～285 d。

(2)對不同產地華重樓皂苷含量進行了測定，在8個批次樣品中，只有2個批次樣品重樓皂苷(Ⅰ+Ⅱ+Ⅵ+Ⅶ)含量達到《中國藥典》重樓項下0．6%的限量標準，對小根莖皂苷含量進行了測定，發現其皂苷含量不足主根莖的50%，可能是由于用來檢測的子根莖生長僅為1年左右，有效成分還在積累階段，所以皂苷含量明顯很少。同一產地不同品種重樓含量測定發現，只有雙株子根莖黑籽重樓皂苷(Ⅰ+Ⅱ+Ⅵ+Ⅶ)達到了《中國藥典》重樓項下0．6%的限量標準，卷瓣重樓、狹葉重樓、五指蓮重樓均未合格。

(3)對黑籽重樓中摘除的小根莖進行了測定，發現重樓皂苷(Ⅰ+Ⅱ+Ⅵ+Ⅶ)含量不足主根莖的50%，與子根莖華重樓測定結果趨勢一致。

(4)子根莖重樓皂苷含量部分可以達到藥典標準，且隨著重樓年限的生長，含量可能會逐漸增長，會有確切的療效，可以作為一個新的研究方向研究，能有效提高重樓的繁殖系數、縮短生育周期。

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